开发用于Pseudoalteromonas fuliginea的CRISPR/Cas9诱导基因编辑系统及其在功能基因组学中的应用

《Applied and Environmental Microbiology》：Development of a CRISPR/Cas9-induced gene editing system for Pseudoalteromonas fuliginea and its applications in functional genomics

基因编辑技术CRISPR/Cas9在极地海洋细菌Pseudoalteromonas fuliginea中的应用研究。通过构建优化质粒载体，实现了fliJ、indA、Pf sRNA等基因的高效敲除及csrA基因的敲入与荧光标记，编辑效率达70%以上，显著优于传统同源重组技术，为极地微生物功能研究及生物技术应用奠定基础。 CRISPR/Cas9|基因编辑|极地微生物|基因敲除|荧光标记|同源重组|微生物功能研究|海洋生物技术|Pseudoalteromonas fuliginea|基因插入

　　在极地海洋环境中，微生物的生存和繁衍受到极端低温条件的强烈影响。这一背景下，科学家们对能够适应寒冷环境的微生物进行了深入研究，其中，Pseudoalteromonas 属的细菌因其在生态学和生物技术领域的广泛应用而备受关注。这些细菌不仅在海洋生态系统中扮演重要角色，还被广泛用于生产生物活性化合物，如外源性多糖、色素和抗菌物质。此外，Pseudoalteromonas 还是冷活性酶的重要来源，这使得其在环境微生物学、生物技术和生物医学等领域的研究价值日益凸显。然而，尽管其应用前景广阔，Pseudoalteromonas 的基因操作仍然面临技术挑战，限制了对其基因功能和生态适应机制的深入研究。

传统基因操作方法主要依赖于同源重组技术，但这种方法在 Pseudoalteromonas 中的效率较低，且操作过程繁琐，耗费大量时间和人力。为了克服这一限制，研究团队开发了一种基于 CRISPR/Cas9 技术的基因编辑系统，以提高在 P. fuliginea 中的基因操作效率。这项技术为研究微生物如何适应极端环境提供了新的可能性，同时也为未来的生物技术应用打下了坚实的基础。通过构建一系列优化的编辑载体，研究人员成功实现了对 P. fuliginea 基因组的精准修改，包括基因敲除、基因插入和基因标记等多种编辑方式。该系统的平均编辑效率超过了 70%，显著优于传统的双交叉同源重组方法。

基因编辑的高效性不仅体现在技术层面，还对研究的深度和广度产生了深远影响。例如，fliJ 基因的敲除实验表明，该基因在细菌的运动能力中起着关键作用。当 fliJ 基因被删除后，P. fuliginea 的运动能力明显下降，这一现象通过平板运动实验得到了验证。同时，通过引入外源性 fliJ 基因，研究人员成功恢复了菌株的运动能力，进一步证明了 fliJ 在细胞运动中的功能。类似的实验还应用于 indA 基因的编辑，该基因被认为与色素合成有关。通过删除 indA 基因，研究人员观察到菌株不再能够合成特征性的蓝色色素，这一结果不仅验证了基因编辑的准确性，也揭示了 indA 在代谢途径中的重要作用。

除了结构基因和代谢相关基因，研究团队还成功编辑了非编码小RNA基因，包括 Pf1、Pf2 和 Pf3。在以往的研究中，利用传统方法对这些非编码基因进行编辑的效率极低，仅有不到 0.1% 的成功率。然而，通过 CRISPR/Cas9 技术，研究人员在短时间内实现了对多个小RNA基因的高效编辑，包括单个基因的敲除和多个基因的逐步敲除。这一突破表明，CRISPR/Cas9 技术不仅适用于编码基因的编辑，也能够有效用于非编码基因的研究，从而拓宽了该技术的应用范围。

此外，研究人员还利用 CRISPR/Cas9 技术实现了对 csrA 基因的 C 端截断，通过插入 3×FLAG 标签，构建了 CsrA-3×FLAG 融合蛋白。这一实验不仅验证了 CRISPR/Cas9 技术在基因插入方面的可行性，还为后续的功能研究提供了便利。通过 Western blot 技术，研究人员检测到了 CsrA-3×FLAG 融合蛋白的表达，进一步确认了编辑的准确性。类似地，研究团队还在 tse2 基因的 3′ 端插入了绿色荧光蛋白（GFP），通过荧光显微镜和荧光强度测定，验证了 Tse2-GFP 融合蛋白的表达情况。这些实验不仅展示了 CRISPR/Cas9 技术在构建基因标记方面的灵活性，也为研究蛋白质的功能和动态变化提供了新的工具。

本研究中使用的 CRISPR/Cas9 系统基于 pK18mobsacB-Ery 载体，这一载体已被广泛用于 Pseudoalteromonas 的基因编辑。通过在该载体中插入 Cas9 基因和特定的单导向 RNA（sgRNA）模块，研究人员构建了一系列用于基因编辑的载体。为了确保在 P. fuliginea 中的高效表达，团队选择了与该菌株兼容的启动子，如 Pf1 小RNA的 D4-12 序列。该启动子已被证明在 P. fuliginea BSW20308 中具有较高的转录活性，有助于提高基因编辑的效率。同时，为了防止转录延伸，团队使用了 rrnB T1 序列作为 rho 无关终止子，这一终止子在原核表达系统中已被广泛使用，具有良好的终止效率。

在实验过程中，研究人员采用了共轭转移的方法将 CRISPR/Cas9 载体引入 P. fuliginea。这一方法依赖于 E. coli 和 P. fuliginea 之间的基因交换。为了筛选成功转移的菌株，研究人员使用了含有红霉素的 2216E 培养基，并通过 PCR 和 DNA 测序验证了基因编辑的准确性。在某些情况下，如 csrA 基因的编辑，由于该基因在细胞存活中具有重要作用，其编辑效率相对较低。这表明，在某些关键基因的编辑过程中，需要谨慎设计实验方案，以确保编辑不会导致菌株的死亡或功能丧失。

为了进一步验证 CRISPR/Cas9 系统的可靠性，研究人员还进行了多组实验，包括基因敲除、基因插入和基因标记。这些实验不仅覆盖了编码基因，还包括了非编码基因和调控元件。通过这些实验，研究人员能够系统地评估 CRISPR/Cas9 技术在 P. fuliginea 中的适用性，并探索其在不同基因编辑任务中的表现。例如，在 csrA 基因的编辑中，研究人员通过构建一个携带 CsrA 前 50 个氨基酸的供体片段，实现了对 CsrA 基因的 C 端截断，从而在不影响菌株存活的前提下研究其功能。这一策略为编辑关键基因提供了新的思路，即通过部分功能的丧失而非完全删除，来研究基因在细胞中的作用。

在基因插入实验中，研究人员利用 CRISPR/Cas9 技术在 csrA 基因的 3′ 端插入了 3×FLAG 标签，并在 tse2 基因的 3′ 端插入了 GFP 报告基因。这些插入实验不仅验证了 CRISPR/Cas9 技术在基因编辑中的灵活性，还为后续的功能研究提供了可视化手段。例如，通过 GFP 荧光强度的测定，研究人员能够评估 Tse2-GFP 融合蛋白的表达水平，从而间接了解 Tse2 蛋白的功能。这些实验结果表明，CRISPR/Cas9 技术不仅能够实现精准的基因编辑，还能够用于构建功能标记，从而为微生物的功能研究提供支持。

本研究的成果为 P. fuliginea 基因编辑技术的发展提供了重要的参考。通过构建一系列优化的编辑载体，研究人员成功实现了对多个基因的高效编辑，包括结构基因、代谢相关基因、调控元件和非编码基因。这一系统的建立不仅提高了基因编辑的效率，还为研究极地海洋微生物的适应机制和生物技术应用提供了新的工具。此外，该技术的灵活性和高效性使其能够应用于不同类型的基因编辑任务，如基因敲除、基因插入和基因标记，从而为微生物功能研究提供了多样化的手段。

CRISPR/Cas9 技术的引入为 P. fuliginea 的研究开辟了新的方向。该系统能够支持多种基因编辑操作，包括精准的基因删除和插入，这为研究微生物在极端环境中的适应机制提供了强有力的支持。通过该系统，研究人员可以更深入地探索 P. fuliginea 在极地海洋环境中的生存策略，包括其运动能力、代谢途径和调控网络等。此外，该技术还为微生物的生物技术应用提供了新的可能性，如利用其冷活性酶进行工业生产，或利用其生物活性化合物开发新型药物。

在本研究中，研究人员不仅验证了 CRISPR/Cas9 技术在 P. fuliginea 中的可行性，还通过多个实验展示了其在不同基因编辑任务中的表现。这些实验包括对 fliJ、indA、Pf1–Pf3 等基因的编辑，以及对 csrA 和 tse2 基因的标记。实验结果表明，该系统在大多数基因编辑任务中表现出较高的效率，平均编辑效率超过了 70%。这一成果不仅为 P. fuliginea 的基因操作提供了新的解决方案，也为其他极地微生物的研究提供了借鉴。

本研究的成果具有重要的科学意义和应用价值。首先，它为研究极地微生物的适应机制提供了高效的基因编辑工具，使得科学家能够更准确地解析这些微生物在极端环境中的生存策略。其次，该技术的建立有助于推动 Pseudoalteromonas 在生物技术领域的应用，如开发新型酶制剂、抗菌药物和生物活性化合物。此外，该系统的可扩展性意味着它不仅可以用于 P. fuliginea，还可以应用于其他 Pseudoalteromonas 菌株，从而拓展了研究的范围。

总之，这项研究展示了 CRISPR/Cas9 技术在 P. fuliginea 基因编辑中的强大潜力。通过构建一系列优化的编辑载体，研究人员实现了对多种基因的高效编辑，包括结构基因、代谢相关基因、调控元件和非编码基因。这些成果不仅提高了基因编辑的效率，还为研究极地微生物的适应机制和生物技术应用提供了新的工具。随着技术的不断完善，未来有望在更多微生物研究领域中应用这一系统，推动微生物生态学、环境微生物学和海洋生物技术的发展。