通过泰国汉逊酵母和库德里阿兹威毕赤酵母发酵调控黑巧克力的抗氧化剂和甲基黄嘌呤谱系

《Food Biophysics》：Modulation of Antioxidant and Methylxanthines Profiles in Dark Chocolate Via Cocoa Fermentation with Hanseniaspora Thailandica and Pichia Kudriavzevii

本研究针对可可豆传统发酵过程中多酚损失严重的问题，系统探讨了采用泰国汉逊酵母（HT）和库德里阿兹威毕赤酵母（PK）作为发酵剂对黑巧克力功能成分的调控作用。结果表明，HT和PK发酵能显著提升巧克力中咖啡因（0.098 mg/g）和可可碱（0.534 mg/g）含量，同时通过协同作用使混合发酵组的总多酚含量（TPC）达到最高。该研究为开发具有增强甲基黄嘌呤谱系的功能性巧克力产品提供了科学依据，对推动精准发酵技术在可可加工中的应用具有重要意义。

　　

在健康食品日益受到关注的今天，黑巧克力因其富含多酚类物质而备受推崇。可可豆（Theobroma cacao L.）作为巧克力的原料，含有丰富的多酚化合物，这些成分具有显著的健康益处。然而，传统的可可豆加工过程往往导致多酚含量的大幅降低，尤其是小规模农户采用的自然发酵方式，容易产生过酸或风味不佳的豆子，制约了高品质巧克力的开发。

为了解决这一行业痛点，研究人员开始探索通过控制发酵过程来改善可可豆品质。酵母作为发酵过程中的关键微生物，能够分解可可浆中的糖分，产生乙醇和风味活性代谢物，这些物质可被可可子叶吸收，进而影响巧克力的最终风味。尽管已有研究表明使用发酵剂可以提高可可豆品质的一致性，但特定酵母菌株对黑巧克力中甲基黄嘌呤（包括可可碱和咖啡因）含量的影响尚未得到充分研究。

在这项发表于《Food Biophysics》的研究中，Teng Sin Ooi等人系统评估了采用泰国汉逊酵母（Hanseniaspora thailandica，HT）和库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii，PK）作为发酵剂对黑巧克力功能成分的影响。研究团队通过实验室规模的发酵实验发现，与自然发酵相比，HT和PK发酵能产生酸度较低的可可豆，这对巧克力中的儿茶素和表儿茶素水平产生了重要影响。

关键技术方法包括：采用混合克隆可可豆进行浅盘发酵（30°C，96小时），通过HPLC-DAD分析 flavanols（黄烷醇）和methylxanthines（甲基黄嘌呤）含量，使用福林酚法测定TPC（总多酚含量），铝盐比色法测定TFC（总黄酮含量），以及DPPH（二苯基苦基苯肼）法评估自由基清除活性。所有巧克力样品均控制颗粒度d₉₀值低于30μm，确保产品质地一致。

TPC（总多酚含量）测定结果

研究发现，使用混合发酵剂（HT+PK）的巧克力TPC值显著高于对照组（p≤0.05），而单一酵母发酵与自然发酵无显著差异。这一现象可能源于微生物水解作用释放了更多生物活性化合物。值得注意的是，福林-酚测定法会受抗坏血酸等还原物质干扰，因此实际TPC可能存在偏差。

TFC（总黄酮含量）变化规律

所有巧克力样品的TFC值在23.61-36.84 mg/g CE（儿茶素当量）范围内，高于文献报道值。发酵和烘焙过程中的表儿茶素向儿茶素的差向异构化作用可能是导致黄酮含量升高的主要原因。尽管烘焙会降解(+)-儿茶素，但(-)-儿茶素的生成仍能维持总体黄酮水平。

DPPH自由基清除活性

自然发酵的对照组巧克力表现出最高的DPPH抑制率（42.91 μmol/g TE），而加纳巧克力最低（29.8 μmol/g TE）。这种差异可能与发酵过程中产生的抗氧化代谢物有关，但烘焙过程的高温会降解部分抗氧化成分。加纳豆因产地处理方式不同，其抗氧化活性呈现显著差异。

黄烷醇和甲基黄嘌呤谱系分析

HPLC-DAD检测显示，对照组巧克力的儿茶素（0.079 mg/g）和表儿茶素（6.969 mg/g）含量最高，而HT发酵巧克力的儿茶素最低（0.017 mg/g）。在甲基黄嘌呤方面，PK发酵巧克力的可可碱含量最高（0.534 mg/g），HT发酵巧克力的咖啡因含量最高（0.098 mg/g），均显著高于对照组和加纳样品（p≤0.05）。研究人员认为，酵母发酵剂可能通过抑制曲霉菌等具有生物脱可可碱作用的丝状真菌生长，从而保留更多甲基黄嘌呤。

相关性分析揭示作用机制

TPC与TFC在PK发酵巧克力中呈现强相关性（r=0.723），表明黄酮是可可多酚的主要组成部分。HT发酵巧克力中，儿茶素与TPC（r=0.716）、表儿茶素与TPC（r=0.708）均呈强相关，说明HT发酵能特异性增强这些成分的利用率。值得注意的是，甲基黄嘌呤与抗氧化活性的相关性较弱，表明巧克力的抗氧化性能主要取决于多酚类物质而非生物碱。

研究结论强调，酵母发酵剂对巧克力中儿茶素、表儿茶素和甲基黄嘌呤含量的调控作用比对抗氧化活性的影响更为显著。HT和PK作为发酵剂能有效提升巧克力的功能性成分，特别是可可碱和咖啡因含量。鉴于可可碱具有止咳等多种健康益处，该研究为开发功能型巧克力产品提供了新思路。通过精准控制发酵微生物，有望生产出具有特定健康功效的定制化巧克力，推动可可加工向精准化、功能化方向发展。