新型表面功能化镁合金作为临时骨植入物的微生物学及体外降解响应研究

《Applied Surface Science Advances》：Microbiological and in vitro degradation response of a magnesium alloy with new surface functionalization for use as temporary bone implants

本研究针对AZ91镁合金作为可降解骨植入物存在的早期腐蚀速率快和易引发感染等问题，开发了一种结合碳酸盐/磷酸盐预处理和负载庆大霉素的二氧化硅纳米颗粒(Si-Ge NP)的表面功能化策略。研究通过表面表征、电化学测试、抗菌实验及细胞相容性评估，证实该复合涂层能有效延缓合金在模拟体液(SBF)中的早期降解，降低腐蚀电流密度，并通过对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的显著抑制作用展现出优异的抗菌性能，同时保持良好的成纤维细胞相容性。该研究为开发兼具可控降解、抗感染和生物相容性的新型骨科植入材料提供了突破性方案。

　　

在骨科手术中，临时性骨植入物常用于固定骨折部位，直至骨骼愈合。然而，传统金属植入物如不锈钢或钛合金，在完成使命后通常需要二次手术取出，这不仅增加了患者的痛苦和经济负担，也带来了额外的手术风险。因此，生物可降解材料成为了研究的热点。镁(Mg)及其合金，特别是AZ91D镁合金（含有9%铝和1%锆），因其与骨骼相似的力学性能、在人体内的天然存在以及可被安全吸收代谢的特性，被视为极具潜力的临时骨植入材料。但镁合金有一个致命的缺点：在生理环境中腐蚀速率过快，尤其是在植入初期，会伴随产生大量的氢气，可能导致植入部位发炎、疼痛，甚至植入失败。此外，任何外科手术都伴随着感染的风险，如何在不使用全身性抗生素（以避免细菌耐药性）的前提下，有效预防植入物相关感染，是另一个亟待解决的难题。

为了同时解决镁合金的快速腐蚀和潜在感染问题，研究人员将目光投向了表面改性技术。理想的表面改性应该像一个“智能盔甲”，既能控制镁合金的降解速度，使其与骨愈合速率相匹配，又能局部释放抗生素，主动防御细菌侵袭。以往的研究尝试了多种方法，但往往工艺复杂、成本高昂，或难以同时满足多重需求。因此，开发一种简单、经济且高效的双功能表面处理方案，对于推动可降解镁合金植入物的临床应用至关重要。

正是在这样的背景下，Melina I. Hankovits、Julieta L. Merlo、Nabila Yasmeen、Anna-Maria Pappa、Josefina Ballarre和Silvia M. Ceré等研究人员在《Applied Surface Science Advances》上发表了他们的最新研究成果。他们设计并评估了一种用于AZ91镁合金的新型表面功能化策略，该策略结合了简单的碳酸盐-磷酸盐预处理和负载抗生素（庆大霉素）的二氧化硅纳米颗粒(Si-Ge NP)涂层，旨在实现对降解速率的初期控制，并赋予材料抗菌特性，同时保持其生物相容性。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，对AZ91镁合金基底进行抛光预处理。其次，利用碳酸氢钠(NaHCO₃)和磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)混合溶液对部分样品进行预处理，形成碳酸盐-磷酸盐转化层。接着，通过改良的St?ber法合成了负载庆大霉素的二氧化硅纳米颗粒(Si-Ge NP)，并通过滴涂法将其沉积在预处理过的合金表面。材料表征方面，采用了扫描电子显微镜(SEM)观察表面形貌，X射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析表面化学组成，轮廓仪测量表面粗糙度，以及接触角测量仪评估表面润湿性。生物学评价则包括溶血实验（使用新鲜人血）、体外降解实验（在模拟体液SBF中浸泡）、电化学测试（电化学阻抗谱EIS和动电位极化曲线PC）以评估降解行为，抗菌实验（针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌），以及细胞相容性实验（使用小鼠成纤维细胞L-929进行直接接触培养）。

3. 结果与讨论

3.1. 表面形貌与化学成分

表面粗糙度测量显示，经碳酸盐/磷酸盐预处理后，AZ91合金的表面粗糙度参数Ra和Rz显著增加，这为细胞粘附提供了更多的锚定点，也可能有利于纳米颗粒的附着。接触角测量表明，预处理使表面变得高度亲水，而沉积Si-Ge NP后，表面亲水性进一步增强，水滴接触角无法测量，表明纳米颗粒表面的-OH基团与水分子的快速相互作用。扫描电子显微镜(SEM)图像清晰地展示了不同处理阶段的表面形态：抛光后的表面可见均匀的抛光纹路；预处理后的表面形成了一层交联或缠结的网状结构；而在预处理基础上沉积Si-Ge NP后，可见纳米颗粒成功附着在预处理形成的网状结构的空隙中，呈现出双峰尺寸分布（80和140纳米），较小的颗粒更易团聚，而较大的颗粒则呈现有序的线性排列 pattern。研究人员提出了一个锚定机制模型：镁在水中的反应生成羟基，磷酸盐和碳酸盐与镁阳离子反应，随后Si-Ge NP通过Si-O或N-O键与处理后的材料结合，或通过机械互锁作用附着在粗糙表面上。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析进一步证实了表面化学组成的变化。未经浸泡的抛光样品光谱未见磷酸盐或碳酸盐特征峰。浸泡1天后，出现了Mg-(OH)等相关振动峰。浸泡7天后，在1083 cm^-1处出现了磷酸根离子(PO₄^3-)的υ₃振动峰，表明在生理条件下开始具有生物活性。预处理后的样品在未浸泡时即可观察到与C和O（来自碳酸盐介质）相关的键合信号，以及氧化镁的特征峰。浸泡7天后，所有样品表面均在1410 cm^-1处出现了碳化羟基磷灰石(CHAp)的特征峰，这对于骨科应用是极其有利的。对于沉积了Si-Ge NP的样品，其FTIR光谱在未浸泡时主要显示硅化合物（如Si-O-Si, Si-O-Mg, Si-OH）的特征峰，但这些信号在浸泡7天后消失，结合SEM观察结果，表明纳米颗粒可能在浸泡过程中被释放或溶解到介质中。

X射线光电子能谱(XPS)分析为表面化学状态提供了更深入的证据。O 1s峰的结合能从抛光样品的531.7 eV偏移至NP涂层样品的532.6 eV，证实了羟基和磷酸盐相互作用的存在。C 1s谱图中，所有样品表面均存在吸附碳，预处理样品还显示出C-O键的特征，可能与碳酸盐形成有关。P 2p峰在预处理样品中位于133.5 eV附近，证实了磷酸盐层的形成，而在NP涂层样品中该峰位移至135.2 eV，可能与纳米颗粒通过P-O键与预处理层相互作用有关。Si 2p峰在104.2 eV处的出现，明确证实了二氧化硅纳米颗粒的成功引入。

3.2. 降解行为与电化学性能

通过浸泡在模拟体液(SBF)中7天来评估表面的降解行为。SEM图像显示，浸泡7天后，所有样品表面均出现明显的普遍降解迹象，形成凹陷和表面沉积物。预处理和NP涂层的样品表面可见典型的团聚状羟基磷灰石(HA)形貌的磷酸盐化合物形成。

电化学测试结果与形貌观察相一致。电化学阻抗谱(EIS)的奈奎斯特图显示，在未浸泡条件下，所有样品均呈现两个明显的时间常数，表明存在两个电化学过程。浸泡1天后，预处理样品的总阻抗值有所增加，说明表面处理层在浸泡初期仍能提供一定的保护。然而，浸泡7天后，预处理样品和NP涂层样品的总阻抗值与仅抛光样品趋于接近，表明样品发生了持续降解。通过等效电路拟合数据计算的总电阻(R_TOT)和有效电容(Ceff)进一步证实了这一点。预处理样品在浸泡1天后的总电阻相对较高，Ceff值较低，提示表面形成了更具保护性的层。但到7天时，所有样品的Ceff值均增加，总电阻变化不大，表明保护层逐渐退化。特别值得注意的是，NP涂层样品在浸泡7天后的Ceff值甚至低于未浸泡的抛光样品，这可能与FTIR检测到的CHAp相关化合物的形成有关。

动电位极化曲线测试得到的腐蚀电流密度(i_corr)和腐蚀速率(?_corr)更直观地反映了降解程度的差异。计算结果表明，无论是预处理样品还是NP涂层样品，其i_corr和?_corr在整个浸泡期间均低于仅抛光样品。例如，在未浸泡时，抛光样品的腐蚀速率约为3.45 mm/年，而预处理和NP涂层样品分别降至2.53和1.94 mm/年。浸泡1天后，这种保护作用更为明显，NP涂层样品的腐蚀速率降至0.93 mm/年，远低于抛光样品的7.54 mm/年。这些电化学结果与FTIR中检测到的氧化物以及Ceff的降低和电流密度的减小相吻合，共同证明了表面处理在浸泡早期能轻微增强耐腐蚀性，从而有助于减缓初期的氢析出。

3.3. 生物相容性与抗菌性能

溶血实验结果表明，抛光AZ91的溶血率约为30.8%，属于溶血材料范围。经过预处理后，溶血率降至15.4%，而沉积Si-Ge NP后，进一步降低至11.9%。虽然仍高于5%的理想标准，但表面改性显著提高了材料的血液相容性，表明其作为骨科植入材料的潜力。

抗菌性能是本研究的关键目标之一。针对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性）和大肠杆菌（革兰氏阴性）的抗菌测试显示，抛光AZ91合金本身因其降解导致周围环境碱化，对细菌生长有一定的抑制作用，但效果有限。预处理后的表面，可能由于粗糙度增加为细菌提供了附着点，其抗菌效果与抛光样品相似或更差。然而，沉积了Si-Ge NP的样品表现出极强的抗菌能力，在6小时和24小时均能显著降低两种细菌的存活率。这主要归功于Si-Ge NP中庆大霉素的持续释放。研究表明，约50%的庆大霉素在生理介质中浸泡24小时后释放，其局部浓度能够有效高于细菌的最低抑菌浓度(MIC)，同时又低于对细胞产生毒性的最大浓度(C_MAX)，从而在有效抗感染的同时保障了生物安全性。

细胞相容性通过小鼠成纤维细胞L-929的直接接触实验进行评估。培养24小时和72小时后，荧光染色显示，在所有样品表面均有成纤维细胞粘附。对照组细胞在盖玻片上铺展良好。在抛光AZ91上，部分细胞呈圆形，部分沿抛光方向伸长。在预处理AZ91上，由于粗糙度增加，细胞呈现铺展较差或圆形的形态，这可能是由于提供了多个细胞锚定点。在沉积了NP的样品上，细胞主要聚集在纳米颗粒沉积物附近的区域，而不是直接在上面，细胞形态更圆，密度更高。重要的是，在所有表面条件下均观察到了成纤维细胞的增殖，表明所开发的纳米颗粒涂层允许细胞在其表面存活和粘附，具有良好的细胞相容性。

4. 结论

本研究成功开发并验证了一种用于AZ91镁合金的简单、创新的表面功能化方案。该方案通过碳酸盐-磷酸盐预处理和后续负载庆大霉素的二氧化硅纳米颗粒(Si-Ge NP)沉积，实现了双重目标：一方面，预处理层为纳米颗粒提供了有效的锚定位点，并在模拟体液(SBF)浸泡初期减缓了合金的降解速率，表现为更低的腐蚀电流密度和有效电容；另一方面，Si-Ge NP的引入赋予了材料强大的抗菌能力，能显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，且效果在初期尤为明显。同时，改性后的表面表现出改善的血液相容性（溶血率降低）和支持成纤维细胞粘附与增殖的能力，表明其具有良好的生物相容性。

综上所述，这种结合了可控降解、抗感染和生物相容性的表面功能化策略，为开发新一代可降解骨科植入物提供了有前景的解决方案。它有效地解决了镁合金作为临时骨植入物面临的核心挑战——过早降解和手术部位感染，避免了二次取出手术的需要，并减少了对抗全身性抗生素的依赖，在骨科手术感染控制领域具有重要的突破性意义和应用潜力。