假基因RPS27AP5编码的泛素与核糖体蛋白变体在核糖体功能中的新作用

《Biochemistry and Cell Biology》：The pseudogene RPS27AP5 expresses ubiquitin and ribosomal protein variants with potential roles in ribosome function

本研究针对传统认为无功能的假基因可能具有生物学功能这一科学问题，聚焦泛素（Ub）和核糖体蛋白假基因。研究人员发现RPS27A假基因RPS27AP5可表达泛素变体（UbP5）和核糖体蛋白S27a变体（S27aP5），后者能整合入80S单核糖体并影响特定mRNA（如KDM6B、BMI1）的翻译，进而调控p16INK4A表达。该发现为假基因功能及核糖体功能多样性提供了新证据，具有重要意义。

　　

在基因组中，存在着大量被称为“假基因”的DNA序列。它们与正常基因序列相似，但由于突变积累，传统上被认为是失去了功能的进化遗迹，常被归为“垃圾DNA”。然而，随着研究的深入，科学家们逐渐发现，许多假基因并非完全沉默，它们可能被转录甚至翻译，在细胞中扮演着未被充分认识的调控角色。这引发了一个关键的科学问题：这些假基因是否真的具有生物学功能？如果答案是肯定的，它们又是如何发挥作用的？

泛素（Ubiquitin, Ub）是一种在真核生物中至关重要的调控蛋白，它通过共价结合到靶蛋白上，像标签一样调控着靶蛋白的稳定性、活性和定位，其中最广为人知的功能是标记蛋白质并通过蛋白酶体进行降解。人体内编码泛素的基因主要有四个：UBB、UBC、UBA52和RPS27A。值得注意的是，UBA52和RPS27A编码的是泛素与核糖体蛋白的融合蛋白，例如RPS27A基因编码的蛋白前体包含一个泛素和一个核糖体蛋白S27a（eS31），两者在翻译后会被切割开，各自成熟并发挥功能。核糖体是细胞的蛋白质合成工厂，由数十种核糖体蛋白和rRNA组装而成。有趣的是，核糖体蛋白基因是产生假基因最多的家族之一，这不禁让人猜想，这些核糖体蛋白假基因是否可能表达出变体蛋白，进而形成具有特殊功能的“特化核糖体”，从而为基因表达调控增加新的层次？

为了回答这些问题，由Anna Meller、Jennifer Raisch、Dominique Lévesque、Etienne Fafard-Couture、Michelle Scott、Xavier Roucou和Francois-Michel Boisvert组成的研究团队，对源自泛素和泛素样蛋白（Ubl）的假基因进行了系统性筛选和功能表征。他们的研究成果发表在《Biochemistry and Cell Biology》上，揭示了假基因RPS27AP5能够表达功能性的泛素变体和核糖体蛋白变体，并初步阐明了后者在核糖体组装和mRNA翻译偏好性中的潜在新功能。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们首先通过生物信息学数据库（如Pseudogene.org, PseudoPipe）筛选出候选的Ub/Ubl假基因，并利用核糖体图谱（Ribosome Profiling）和大型质谱数据集（通过OpenProt, PepQuery分析）验证其翻译证据。功能研究主要在HeLa和hTERT-RPE-1等细胞系中进行，通过分子克隆构建带标签（如HA, Myc）的表达质粒进行过表达。蛋白质相互作用通过免疫共沉淀结合基于TimsTOF Pro离子淌度质谱的DIA（数据非依赖采集）蛋白质组学进行分析。核糖体整合通过蔗糖密度梯度离心（核糖体提取和多核糖体分析）证实。mRNA翻译偏好性则通过翻译核糖体亲和纯化（TRAP）结合RNA测序（RNA-seq）进行评估。此外，还采用了免疫印迹（Western Blot）、免疫荧光、荧光素酶报告基因检测以及CUT&RUN（靶向切割并释放使用核酸酶）等技术来验证特定蛋白表达、定位和表观遗传修饰变化。

结果

泛素假基因的收集与初步鉴定

研究人员从人类基因组数据库中系统性地搜寻了源自泛素（Ub）和泛素样（Ubl）蛋白的假基因。经过严格的筛选标准，包括与亲本泛素序列的氨基酸同一性≥90%、保留C末端甘氨酸-甘氨酸（Gly-Gly） motif、以及存在核糖体图谱和蛋白质组学证据，他们最终鉴定出5个具有潜在功能的Ub假基因进行深入分析，其中包括RPS27AP5。序列比对显示，这些假基因编码的泛素区域存在数个氨基酸差异。特别引人注目的是，RPS27AP5不仅编码一个泛素变体（UbP5），其开放阅读框还延伸编码了一个近乎全长的核糖体蛋白S27a变体（S27aP5），这与它的亲本基因RPS27A的结构相似。通过免疫印迹和免疫荧光分析，研究人员证实了UbP5和S27aP5能够在细胞中表达，并且UbP5能够像典型泛素一样与细胞内的蛋白质底物结合，形成高分子量的共轭物，这一过程可被蛋白酶体抑制剂MG132所增强，提示其可能参与蛋白酶体降解途径。

RPS27AP5编码泛素和核糖体蛋白变体的特性

研究人员通过PCR和测序验证了RPS27AP5的基因组DNA和mRNA序列，确认其为一个缺乏内含子的加工型假基因。S27aP5蛋白与亲本S27a蛋白相比，仅有四个氨基酸差异（K89R, V102L, R116C, R118H）。当在细胞中表达带有N端HA标签和C端Myc标签的RPS27AP5融合构建体时，免疫荧光显示泛素（UbP5）和核糖体蛋白（S27aP5）在翻译后能够被切割开，并分别定位于不同的细胞区域：UbP5遍布整个细胞，而S27aP5则主要定位于核仁和细胞质，这与亲本S27a蛋白的定位模式相似，表明S27aP5经历了类似的加工和运输过程。然而，与亲本蛋白相比，S27aP5的蛋白表达水平较低且半衰期更短，蛋白酶体抑制只能部分恢复其水平，提示其稳定性受到蛋白酶体途径的调控。

RPS27aP5相互作用蛋白及靶标的鉴定

为了探究UbP5和S27aP5的功能，研究人员进行了免疫共沉淀结合质谱分析来鉴定它们的相互作用蛋白。UbP5的相互作用组分析显示，它与蛋白酶体成分、泛素结合酶以及去泛素化酶等均有相互作用，表明其功能与典型泛素相似，但也存在一些独特的相互作用伙伴，如去泛素化酶OTUB1，这提示UbP5可能具有细微的功能特异性。更重要的是，对S27aP5的相互作用组分析发现，它与40S小亚基和60S大亚基的多种核糖体蛋白都存在相互作用，强烈暗示它能够被整合进核糖体复合物中。这一发现通过蔗糖密度梯度离心实验得到了进一步证实：S27aP5确实与核糖体组分共同沉降。然而，与亲本S27a相比，S27aP5的相互作用组中缺少了一些与40S核糖体亚基成熟相关的因子（如RIOK2），这可能意味着含有S27aP5的核糖体在成熟过程中存在差异。

S27aP5在核糖体内的作用

为了更精细地了解S27aP5整合进入的核糖体类型，研究人员进行了多核糖体分析。该技术通过蔗糖密度梯度离心将细胞提取物中的核糖体亚基（40S, 60S）、单核糖体（80S）和多核糖体（两个及以上核糖体结合在同一mRNA上）分离开。结果显示，过表达S27aP5会导致80S单核糖体峰的比例增加，并且S27aP5蛋白本身主要存在于80S单核糖体组分中，同时也存在于多核糖体组分。这表明S27aP5能够整合进入具有翻译活性的核糖体，但其在单核糖体中的富集可能暗示了其功能的特殊性。

由含S27aP5核糖体翻译的蛋白质的鉴定

接下来，研究人员利用翻译核糖体亲和纯化（TRAP）技术，特异性捕获与S27a或S27aP5结合的、正在被翻译的mRNA，并通过RNA测序（RNA-seq）进行比较。分析发现，绝大多数与两种核糖体结合的mRNA是相同的，说明含有S27aP5的核糖体具备基本的翻译功能。然而，差异表达分析揭示了一些有趣的偏好性：与含有S27aP5的核糖体特异性结合的mRNA中，富集了与细胞衰老相关的基因，例如组蛋白去甲基化酶KDM6B和Polycomb抑制复合物1（PRC1）的组分COMMD3-BMI1。已知KDM6B能去除抑制性组蛋白标记H3K27me3，从而激活CDKN2A（编码p16^INK4A蛋白）的转录，而BMI1则抑制CDKN2A的表达。为了验证这一发现的功能后果，研究人员检测了过表达S27aP5后p16^INK4A的蛋白水平，发现其有所下降。进一步的CUT&RUN实验表明，在CDKN2A基因的启动子区域，H3K27me3的水平在S27aP5过表达细胞中略有增加，这可能是导致p16^INK4A表达下调的原因。这些结果提示，含有S27aP5的核糖体可能通过选择性翻译特定mRNA，间接影响与细胞衰老相关的基因表达程序。

结论与讨论

本研究系统地鉴定了具有潜在编码能力的泛素假基因，并深入揭示了RPS27AP5这一加工型假基因的双重功能：它能够表达出功能性的泛素变体（UbP5）和核糖体蛋白S27a变体（S27aP5）。UbP5能够参与典型的泛素-蛋白酶体降解途径。更为重要的是，S27aP5可以被整合到核糖体中，并且过表达S27aP5会改变核糖体群体的组成，增加80S单核糖体的比例。虽然含有S27aP5的核糖体保留了基本的翻译能力，但它们显示出与一组特定mRNA（尤其是与细胞衰老通路相关的mRNA）结合的偏好性，并可能通过影响组蛋白修饰间接调控如p16^INK4A等关键蛋白的表达。

这项研究的意义在于，它强有力地挑战了假基因是“垃圾DNA”的传统观念，为假基因能够作为功能性蛋白质的来源提供了直接证据。更重要的是，它首次报道了一个核糖体蛋白假基因编码的变体能够整合入核糖体，并可能赋予核糖体以功能上的特异性。这为“核糖体功能多样性”这一新兴概念提供了新的支持，即核糖体并非均一的翻译机器，其组成的细微差异（例如整合了变体核糖体蛋白）可能使其倾向于翻译特定的mRNA群体，从而在细胞命运决定、应激反应等过程中发挥精细的调控作用。当然，本研究主要基于基因过表达模型，未来需要在内源性水平上进一步验证S27aP5的功能，并深入探索其影响mRNA选择性的具体分子机制。总之，该研究开辟了通过假基因探索核糖体生物学和翻译调控的新视角，对理解基因表达调控的复杂性和开发相关疾病的新策略具有启发意义。