橙皮苷抑制α-突触核蛋白聚集的计算生物学研究：MM-PBSA结合自由能与ADMET分析

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Inhibition of α-synuclein aggregation by hesperidin as a potent anti-amyloidogenic polyphenol: A computational approach and MM-PBSA /ADMET analysis

本研究针对帕金森病中α-突触核蛋白异常聚集的难题，通过分子对接和分子动力学模拟筛选出橙皮苷作为高效抗淀粉样蛋白聚集的天然多酚抑制剂。研究显示橙皮苷与α-Syn结合能达-92.69 kJ·mol-1，显著降低β-折叠结构比例（35%→29%），并通过MM-PBSA/ADMET分析验证其成药潜力，为帕金森病的天然药物研发提供新策略。

　　

在神经退行性疾病的复杂图景中，帕金森病（Parkinson's Disease, PD）作为仅次于阿尔茨海默病的第二大常见神经退行性疾病，其病理特征与α-突触核蛋白（α-synuclein, α-Syn）的异常聚集密切相关。这种本质上无序的蛋白质（Intrinsically Disordered Protein, IDP）在特定条件下会发生错误折叠，形成富含β-折叠结构的淀粉样纤维，这些纤维沉积在脑内称为路易体（Lewy Bodies）和路易神经突（Lewy Neurites）的细胞包涵体中，最终导致多巴胺能神经元的死亡，引发运动功能障碍等典型帕金森症状。尽管科学界对帕金森病的认识不断深入，但能够有效阻止或逆转α-突触核蛋白毒性聚集的临床治疗方法仍然匮乏，这成为当前神经科学领域面临的一大挑战。

面对这一难题，研究人员将目光投向了天然产物宝库。多酚类黄酮化合物（Polyphenolic Flavonoids）因其广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎以及干扰淀粉样蛋白形成通路的能力，展现出作为神经保护剂的巨大潜力。这些来源于植物的次生代谢物，如柑橘中富含的橙皮苷（Hesperidin）、桑科植物中的桑色素（Morin）以及杨梅树中的杨梅素（Myricetin），已被多项研究提示可能对神经退行性疾病具有改善作用。然而，它们与α-突触核蛋白相互作用的精确分子机制、结合强度以及对蛋白质构象动态的影响，仍有待系统阐明。

为了回答这些问题，来自伊拉克Middle Technical University, Al Mansour医学院医学实验室技术系的Zainab Abdullah Waheed、Haider Khabt Aboud、Jasem Hanoon Hashim Al-Awadi、Azhaar Mousa Jaffar Al-Mousawy和khudhair Rashid khudhair Alzubaidi研究团队，在《Biochemistry and Biophysics Reports》上发表了一项综合性计算生物学研究。该研究旨在通过先进的计算机辅助药物设计（Computer-Aided Drug Design, CADD）方法，系统评估三种黄酮类化合物——橙皮苷、桑色素和杨梅素——抑制α-突触核蛋白淀粉样聚集的效能，并深入探索其分子作用机制。

研究人员开展此项研究主要运用了几个关键的技术方法：首先，他们从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）获取了α-突触核蛋白的固态核磁共振结构（PDB ID: 2N0A），并利用GROMACS软件包进行结构优化。其次，从PubChem数据库获取黄酮类化合物的三维结构，并使用半经验AM1方法进行几何优化。核心研究手段包括：1) 使用AutoDock 4.2.3进行分子对接（Molecular Docking），预测化合物与α-突触核蛋白在易聚集位点的结合模式和结合能；2) 进行长达250纳秒的分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，在CHARMM27力场下，于生理盐浓度（0.15 mM）和310 K温度（NPT系综）中，模拟蛋白质-配体复合物的动态行为；3) 对模拟轨迹进行深入分析，包括计算均方根偏差（Root Mean Square Deviation, RMSD）、均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation, RMSF）、回转半径（Radius of Gyration, Rg）、溶剂可及表面积（Solvent Accessible Surface Area, SASA）、氢键数量以及利用DSSP（Define Secondary Structure of Proteins）算法分析二级结构变化；4) 进行主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和自由能景观（Free Energy Landscape, FEL）计算，以理解蛋白质的集体运动和构象稳定性；5) 应用分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（Molecular Mechanics/Poisson?Boltzmann Surface Area, MM-PBSA）方法计算结合自由能；6) 使用pkCSM在线工具对先导化合物进行ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质预测。

3.1. PD相关的α-突触核蛋白和黄酮类化合物的治疗潜力

研究人员首先概述了帕金森病与α-突触核蛋白淀粉样聚集的密切关系，指出富含β-折叠的交叉β结构（Cross-β-sheet Conformation）是淀粉样纤维的共同特征。由于蛋白质类药物难以穿透血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB），小分子化合物成为治疗PD的有力候选。黄酮类多酚化合物因其能够与蛋白质带电且天然无序的C末端结合，并具有降解现有纤维、重塑毒性聚集体或引导生成毒性较低的异路物种（Off-pathway Species）的能力而受到关注。本研究基于此背景，选取了16种已知具有抗淀粉样活性的多酚化合物进行初步计算筛选，最终聚焦于橙皮苷、桑色素和杨梅素进行深入研究。

3.2. 结合相互作用分析

分子对接结果显示，橙皮苷与α-突触核蛋白的结合能最优，为6.58 kcal/mol（约合-92.69 kJ·mol^-1），优于桑色素和杨梅素。具体而言，橙皮苷与α-Syn的Ser87、Ile88、Lys96、Leu100、Gly101和Asn103残基形成六个氢键，并与Gly86、Phe94、Lys102和Glu105残基产生疏水相互作用。桑色素和杨梅素则分别形成三个和两个氢键。橙皮苷更广泛的氢键网络和疏水相互作用表明其与α-Syn具有更高的亲和力，预示着更强的抑制聚集潜力。

3.3. α-Syn及其蛋白-配体复合物的几何构象变化

通过250纳秒的分子动力学模拟，研究人员分析了蛋白质结构的动态稳定性。RMSD分析表明，游离的α-Syn平均值为2.75 ± 0.42 nm，而与橙皮苷、桑色素、杨梅素结合后，RMSD平均值分别增至3.2 ± 0.39 nm、3.1 ± 0.57 nm和2.81 ± 0.4 nm。橙皮苷复合物显示出最大的结构偏差，暗示其结合引起了最显著的构象变化，可能破坏了蛋白质天然的、易聚集的结构状态。SASA分析进一步支持了这一结论，橙皮苷复合物的SASA值（147 ± 10 nm²）高于游离α-Syn（136 ± 15 nm²），表明结合后蛋白质结构变得更加松散，内部残基更多暴露于溶剂。

RMSF分析揭示了蛋白质残基的柔性变化。橙皮苷结合使α-Syn的波动性增至1.74 ± 0.46 nm，高于游离状态（1.17 ± 0.45 nm）及其他复合物，说明橙皮苷的结合增加了蛋白质特定区域的柔性，可能干扰了其稳定的相互作用。回转半径（Rg）分析显示，橙皮苷复合物的Rg值（2.31 ± 0.91 nm）略高于游离α-Syn（1.95 ± 0.48 nm），提示复合物的整体紧凑度有所下降，结构更为开放。

氢键分析是理解聚集抑制的关键。模拟发现，游离α-Syn肽链间平均有103 ± 10个氢键，而橙皮苷、桑色素、杨梅素复合物中，肽链间氢键数分别减少至88 ± 11、93 ± 10和92 ± 9个。同时，配体与蛋白质之间维持的氢键数平均值分别为：橙皮苷5 ± 2个，桑色素3 ± 1个，杨梅素2 ± 1个。这表明黄酮类化合物的结合，特别是橙皮苷，竞争性地破坏了α-Syn分子内部的氢键网络，削弱了其自我聚集的驱动力。

3.4. 二级结构、主成分和自由能景观分析

二级结构分析（DSSP）提供了最直接的证据。游离α-Syn的β-折叠含量高达35%。在与橙皮苷结合后，β-折叠含量显著下降至29%，而桑色素和杨梅素复合物中β-折叠含量分别为33%和31%。相应地，无规则卷曲（Coil）含量在橙皮苷复合物中从28%增至32%。这一变化清晰地表明，橙皮苷有效破坏了α-Syn形成淀粉样聚集所必需的β-折叠核心结构，使其向更无序、不易聚集的构象转变。

主成分分析（PCA）将复杂的蛋白质运动简化为主要模式。PCA投影图显示，游离α-Syn的构象分布范围最广，表明其具有较高的内在灵活性。而与黄酮类化合物，特别是橙皮苷结合后，复合物的构象分布变得更加集中，运动幅度减小，提示配体结合限制了蛋白质的构象空间，使其稳定性增加。自由能景观（FEL）分析进一步揭示了不同状态下的能量最低点。游离α-Syn存在多个能量最小值，对应于多种可能促进聚集的亚稳态构象。而橙皮苷复合物的自由能景观则显示构象被限制在更小的、能量较低的区域内，表明橙皮苷的结合稳定了蛋白质结构，减少了其向毒性聚集构象转化的可能性。

3.5. 分子力学泊松-玻尔兹曼表面积计算与ADMET评价

MM-PBSA计算定量评估了结合自由能。橙皮苷与α-Syn的结合自由能（ΔE_binding）为-92.69 ± 0.31 kJ·mol^-1，显著低于桑色素（-83.95 ± 2.77 kJ·mol^-1）和杨梅素（-77.54 ± 2.86 kJ·mol^-1）。能量分解表明，范德华相互作用和静电相互作用是驱动结合的主要有利因素，而极性溶剂化能则不利于结合。该结果与分子对接和动力学模拟结论高度一致，再次确认了橙皮苷是最强的结合剂。

最后，通过计算ADMET性质评估了先导化合物橙皮苷的成药潜力。预测结果显示，橙皮苷的口服生物利用度（31.48%吸收）相对较低，这与其较大的分子量和糖苷结构有关，但其血脑屏障渗透性（BBB permeability, log PS = -1.715）表明其可能具有一定的入脑能力。重要的是，橙皮苷在AMES毒性、肝毒性和皮肤致敏性预测中均显示为阴性，提示其具有较好的安全性。研究人员也讨论了通过制剂策略（如纳米包裹）改善橙皮苷生物利用度的可能性。

研究结论与意义

本研究通过系统的计算生物学方法，令人信服地表明天然黄酮类化合物橙皮苷能够高效地与α-突触核蛋白结合，并显著抑制其病理性淀粉样聚集。橙皮苷通过形成广泛的氢键和疏水相互作用，竞争性地破坏α-Syn分子间的氢键网络，降低β-折叠结构含量，增加蛋白质柔性，并使其构象趋于稳定，从而有效阻断了淀粉样纤维的形成途径。在筛选的三种化合物中，橙皮苷展现出最优的结合亲和力（ΔE_binding -92.69 kJ·mol^-1）和最强的β-折叠破坏能力（从35%降至29%），使其成为极具潜力的抗帕金森病先导化合物。

这项研究的重要意义在于：首先，它从分子层面深入揭示了橙皮苷抗α-突触核蛋白聚集的作用机制，为理解天然多酚的神经保护功能提供了新的理论依据。其次，研究整合了分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算以及ADMET预测等多种先进计算技术，构建了一套完整的天然药物虚拟筛选与评价体系，为后续针对神经退行性疾病的药物研发提供了可借鉴的方法学框架。最后，研究结果强有力地支持了橙皮苷作为治疗帕金森病的候选药物进行进一步实验验证和临床前开发的价值。鉴于橙皮苷广泛存在于柑橘类水果中，安全性较高，这项研究也为通过膳食补充或开发功能性食品来预防或辅助治疗神经退行性疾病提供了科学线索。尽管仍需后续的体外和体内实验证实，但本研究无疑为攻克帕金森病这一顽疾点亮了一盏来自天然产物的希望之灯。