黑鲈多瘤病毒大T抗原通过SF3解旋酶域下游经典核定位信号的Importin α/β1依赖性核转运机制研究

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Importin α/β1 dependent nuclear import of black sea bass polyomavirus large tumor antigen is mediated by a classical NLS located downstream of the SF3 helicase domain

本研究针对多瘤病毒大T抗原（LTA）核定位信号（NLS）在不同宿主来源病毒中的进化与功能差异问题，通过生物化学、结构生物学和功能实验，首次揭示了感染硬骨鱼类的黑鲈多瘤病毒（BSB PyV）LTA通过SF3解旋酶域下游的双分型经典NLS（cNLS）介导Importin（IMP）α/β1依赖性核转运的新机制。该研究不仅阐明了病毒与宿主共进化过程中核转运通路的适应性选择，也为多瘤病毒的分类和宿主适应性研究提供了重要理论依据。

　　

在病毒学研究中，多瘤病毒（Polyomaviruses, PyVs）是一类小型双链DNA病毒，其复制完全依赖于宿主细胞核。病毒编码的大T抗原（Large Tumor Antigen, LTA）是负责病毒基因组复制和调控宿主细胞功能的关键调控蛋白。由于PyVs必须在细胞核内完成其生命周期，因此LTA如何被有效地转运至细胞核内，即其核定位机制，成为病毒复制和致病性的核心问题之一。长期以来，以猿猴病毒40（SV40）为代表的多瘤病毒LTA的核定位信号（Nuclear Localization Signal, NLS）被认为是经典核转运通路（Classical Nuclear Import Pathway）的范例，其NLS（序列为PKKKRKV）位于LXCXE基序和原点结合域（Origin-Binding Domain, OBD）之间，并通过Importin（IMP）α/β1异源二聚体进行识别和核转运。然而，随着越来越多的PyVs在非哺乳动物宿主（如鸟类、鱼类甚至节肢动物）中被发现，这些病毒的LTA序列与哺乳动物感染性PyVs的LTA显示出巨大的差异性。一个引人深思的科学问题是：这些高度差异的LTA是否仍然依赖IMPα/β1通路进行核转运？它们的NLS在序列和位置上是否具有保守性？回答这些问题对于理解病毒与宿主的共进化历程以及核转运机制的演化具有重要意义。

为了深入探究上述问题，由Mikayla Hoad、Silvia Pavan、Sepehr Nematollahzadeh、Ole Tietz、Joseph Reeman、Jade K. Forwood和Gualtiero Alvisi组成的研究团队在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》上发表了他们的最新研究成果。该研究以首个从鱼类（黑鲈）中鉴定出的多瘤病毒（BSB PyV）的LTA为主要研究对象，综合运用生物信息学、生物化学、结构生物学和细胞生物学等多种技术手段，系统阐述了其独特的核转运机制。

研究人员为开展本研究，主要应用了几项关键技术：1）生物信息学分析：利用cNLS mapper等软件预测LTA中的潜在NLS，并通过AlphaFold3进行蛋白结构域预测和三维结构建模；2）蛋白互作分析：通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和荧光偏振（FP） assays，定量测定合成的FITC标记NLS肽段与多种重组Importin蛋白（包括IMPα亚型及IMPβ1-3）的结合亲和力；3）X射线晶体学：解析了BSB PyV LTA的NLS肽段与小鼠Importin α2（mIMPα2ΔIBB）的复合物晶体结构，分辨率达2.2 ?；4）细胞生物学实验：利用人胚胎肾293A（HEK293A）细胞系，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对GFP（绿色荧光蛋白）标记的LTA或其NLS片段进行亚细胞定位的定量分析，并利用IMPα/β1通路竞争性抑制剂Bimax2验证核转运的特异性依赖关系。

3.1. BSB PyV-LTA功能结构域和推定cNLS的鉴定

研究人员首先对BSB PyV-LTA进行了全面的生物信息学分析。与典型的SV40-LTA相比，BSB PyV-LTA的序列一致性仅为27.5%，且其功能结构域呈现出显著差异：例如，其J结构域中缺乏关键的HPDKGG六肽基序，可能丧失功能；其LXCXE基序位于OBD内部，而非其上游。更重要的是，在哺乳动物PyVs LTA中保守的NLS位置（LXCXE与OBD之间），BSB PyV-LTA仅存在一个TPEK肽段，不符合IMPα结合共识序列（K-K/R-X-K/R），暗示其并非功能性NLS。然而，研究团队在SF3解旋酶域下游的无规则卷曲C端区域鉴定出一个高评分的潜在双分型cNLS（660-IAEYKRRHNIGSDGLPNKRRRC-681），提示在高度分化的LTA进化过程中，对经典IMPα/β1核转运通路的依赖性得以保留，但cNLS的位置发生了改变。

3.2. BSB PyV-LTA 660-683残基将核定位赋予GFP并与IMPα旁系同源物高亲和力结合

为了验证该推定NLS的功能，研究人员构建了GFP与BSB PyV-LTA 660-683片段（BSB PyV-LTA;NLS）的融合蛋白。在HEK293A细胞中表达后，CLSM定量分析显示，与均匀分布于胞质和胞核的GFP相比，GFP-BSB PyV-LTA NLS显著富集于细胞核，其核质荧光强度比（Fn/c）高达9.6，与阳性对照（GFP-JC PyV-LTA NLS）效果相当。进一步的体外结合实验表明，合成的FITC标记的BSB PyV-LTA;NLS肽段能够与多种IMPα亚型（α1, α2, α3, α5, α7）以及IMPβ1, β2, β3发生结合。荧光偏振测定显示，该肽段与IMPα7, α5和α2的结合亲和力最高（Kd在纳摩尔级别），而与IMPβs的结合较弱。这些结果证实了BSB PyV-LTA 660-683是一个能够与IMPα高亲和力结合的、功能性的cNLS。

3.3. BSB PyV-LTA通过IMPα/β1被转运至细胞核

接下来，研究团队检测了全长BSB PyV-LTA-GFP在细胞内的定位及其对IMPα/β1通路的依赖性。与SV40-LTA-GFP类似，BSB PyV-LTA-GFP在无其他病毒蛋白存在的情况下，能够高效地定位于细胞核（Fn/c = 7.8）。当与IMPα/β1的特异性抑制剂Bimax2共表达时，SV40-LTA-GFP和BSB PyV-LTA-GFP的核定位均被显著抑制，蛋白被阻滞在细胞质中（Fn/c分别降至0.4和0.3）。这一关键实验证明，尽管BSB PyV-LTA的NLS位置与哺乳动物PyVs不同，但其核转运同样严格依赖于IMPα/β1异源二聚体。

3.4. BSB PyV-LTA;NLS:mIMPα2复合物的结构分析揭示了双分型相互作用机制

为了在原子水平上理解NLS与IMPα的相互作用，研究人员解析了BSB PyV-LTA;NLS肽段与mIMPα2ΔIBB的复合物晶体结构（PDB ID: 9NIB）。结构清晰地显示，BSB PyV-LTA NLS以双分型模式结合：其N端碱性氨基酸簇（664-KRR-666）结合于IMPα2的次要结合位点（minor site），而C端碱性氨基酸簇（674-KRRR-677）结合于主要结合位点（major site）。结构中观察到了典型的盐桥相互作用（如R665与次要位点GLU396，K677与主要位点ASP192）以及多个疏水相互作用，这与已知的双分型NLS结合模式一致。

3.5. BSB PyV-LTA双分型NLS中的两个碱性氨基酸簇对最佳IMPα2结合至关重要

通过将NLS中N端（mNLSn）、C端（mNLSc）或两端（mNLSnc）的碱性氨基酸突变为丙氨酸，研究人员评估了这两个碱性簇对IMP结合的重要性。EMSA和FP实验结果表明，任意一个碱性簇的突变都会削弱与IMPα2的结合，而同时突变两个碱性簇则几乎完全丧失了结合能力。定量数据显示，C端碱性簇对结合的贡献大于N端碱性簇。

3.6. BSB PyV-LTA双分型NLS中的两个碱性氨基酸簇对最佳核积聚至关重要

在细胞水平上，将相应的突变引入全长BSB PyV-LTA-GFP后，CLSM分析显示，N端碱性簇突变（mNLSn）导致核积聚显著下降（Fn/c从8.8降至0.8），部分蛋白滞留于胞质。而C端碱性簇突变（mNLSc）或双突变（mNLSnc）则完全阻断了核定位，蛋白完全分布于胞质（Fn/c降至0.3）。这证实了结构生物学和生化数据的结论，即双分型NLS的两个碱性簇对于有效的IMPα介导的核转运都是必需的，且C端簇的作用更为关键。

3.7. LTA内cNLS的位置定义了高度分化PyVs的宿主范围

研究团队扩展了分析范围，对已知的感染非哺乳动物宿主（包括鱼类、鸟类、蝎子）的PyVs的LTA序列进行了系统的生物信息学分析。结果显示，尽管OBD、Tag-D1结构域、SF3解旋酶域和至少一个推定cNLS在所有分析的LTA中均存在，但cNLS的位置呈现出明显的宿主特异性：鸟类PyVs LTA的cNLS位于Tag-D1结构域内；蝎子PyVs LTA的cNLS位于SF3解旋酶域内；硬骨鱼类PyVs LTA（如BSB PyV）的cNLS位于SF3解旋酶域下游；而软骨鱼类PyVs LTA的cNLS则位于J结构域内。仅有少数（约14%）非哺乳动物PyVs LTA在LXCXE与OBD之间存在推定cNLS，这是哺乳动物PyVs的典型特征。

3.8. 位于非哺乳动物宿主感染PyVs LTA不同结构域中的推定cNLS的功能验证

为了验证生物信息学预测的cNLS的功能性，研究人员选取了寒鸦PyV1 LTA（位于Tag-D1结构域内的cNLS）和巴贾加州树皮蝎PyV1 LTA（位于SF3解旋酶域内的两个cNLS，以及位于LXCXE与OBD之间的一个祖先型cNLS）的推定NLS序列，将其与GFP融合并在HEK293A细胞中表达。定量CLSM分析表明，寒鸦PyV LTA NLS和蝎子PyV LTA NLSb均能显著促进GFP的核定位（Fn/c分别为1.7和3.4），而蝎子PyV LTA NLSa和NLSc的效果较弱。这为非哺乳动物PyVs LTA中存在的、位置各异的推定cNLS具有一定的核靶向功能提供了实验支持。

在讨论部分，作者对研究结果进行了深入阐释。首先，LTA功能结构域的保守性分析表明，所有LTA可能起源于一个具有核靶向和DNA解旋酶活性的共同祖先，随后进化出宿主特异性的功能模块（如J结构域、LXCXE基序）。其次，本研究强有力地证明了不同宿主来源的PyVs LTA在核转运机制上存在功能趋同，即均倾向于利用IMPα/β1通路，这可能与该通路在调控货物核质梯度方面具有更强的鲁棒性有关。第三，BSB PyV-LTA NLS被证实为双分型NLS，其进化可能源于对更高核积聚水平的需求。最引人注目的发现是cNLS在LTA序列中的位置具有宿主特异性，这一特征有望为疑难PyVs的分类提供新的分子标志。例如，根据cNLS位置，未分类的巨型吉他鱼PyV可能与已知的Raja PyV同属一个属；而从蝎子中获得的4个PyVs序列，其LTA共享高度同源性且cNLS均位于SF3解旋酶域，可能代表一个新的属。最后，关于LTA中NLS的进化，作者提出了两种假说：一是祖先NLS原本具有功能，在感染非哺乳动物的PyVs中，其功能被新获得的、位于其他位置的cNLS所替代；二是祖先NLS原本无功能，其在哺乳动物PyVs中获得了功能，而非哺乳动物PyVs则在其他位置进化出了功能性NLS。本研究为第二种假说提供了一定的支持，但最终结论仍需对更多PyVs LTA进行功能验证。

综上所述，这项研究首次详细刻画了感染硬骨鱼类的黑鲈多瘤病毒大T抗原通过一个位于SF3解旋酶域下游的新型双分型经典核定位信号，依赖Importin α/β1通路进行核转运的分子机制。该研究不仅拓展了我们对多瘤病毒核转运机制多样性的认识，揭示了病毒与宿主在共进化过程中对关键细胞通路的适应性利用，而且为基于核定位信号特征的多瘤病毒分类和进化研究提供了新的视角和重要的实验依据。