细胞色素P450酶RufO的底物识别与结构特征：结合机制及其在生物催化硝化中的应用潜力

《Biophysical Chemistry》：RufO, a cytochrome P450 (CYP) enzyme, recognition to putative substrates and a redox partner: Binding and structural insights

本文通过等温滴定量热法（ITC）和晶体结构解析，揭示了细胞色素P450酶RufO的底物混杂性及其与氧化还原伴侣CamB的互作机制。研究发现RufO不识别单体L-酪氨酸，但可结合含甲基/硝基的芳香族化合物，且CamB能将其底物结合亲和力提升约10倍，为开发绿色硝化生物催化剂提供了新视角。

　　

Section snippets

Expression and purification of RufO and CamB

所有化学品均购自Sigma-Aldrich和HiMedia（印度），特殊标注除外。

codon-optimized编码的细胞色素P450 RufO（Uniprot ID: A0A224AU14）序列由Priyanka Bajaj博士馈赠，该序列被克隆至带有C端6×组氨酸标签的pET-22b(+)载体。为表达RufO，用该构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。细胞在补充有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养物于...

ITC binding studies of RufO with putative substrates

通过紫外-可见（UV-vis）光谱初步研究RufO与推定底物的结合情况。单独RufO在420 nm处显示Soret吸收带，与细胞色素P450酶的铁离子低自旋状态一致。经典P450底物相互作用中，底物通常会置换血红素铁的水分子配体，导致Soret峰蓝移（从～420 nm移至～390 nm）。但加入推定底物后，我们未观察到Soret带发生位移...

Discussion

通过结构与生物物理研究，我们深化了对RufO与多种推定底物（尤其在氧化还原伴侣CamB存在下）相互作用的理解。紫外-可见光谱显示加入推定底物后未出现显著光谱变化。ITC数据表明RufO具有底物混杂性。推定底物与RufO的弱结合亲和力提示其单独存在时结合能力较低，但CamB的结合使底物亲和力显著增强约10倍，凸显了氧化还原伴侣的效应器功能。晶体结构揭示了RufO活性位点与其他CYP450酶的异同，其柔性区域可能有助于底物多样性识别。这些发现为利用RufO进行工业相关化合物的生物催化硝化奠定了基础。

Conclusion

本研究揭示了细菌细胞色素P450 RufO的结构特征与底物结合特性，探索了其在工业重要化学转化中作为生物催化剂的潜力。结构数据详细解析了RufO活性位点，可用于多种催化应用。ITC结合研究展现了RufO的底物混杂性与适应性。氧化还原伴侣CamB显著增强了推定底物结合能力，表明其可能通过变构效应调控酶功能。该研究为设计新型硝化生物催化剂提供了理论依据。

（注：由于原文"Highlight"部分未在提供内容中明确出现，翻译从第一个小标题开始。若需补充特定章节请提供具体段落。）