利用酵母细胞内氨基酸积累培育增值酒精饮料的研究进展

《FEMS Yeast Research》：Breeding of yeast strains with intracellular amino acid accumulation for value-added alcoholic beverages

本刊推荐：为解决酒精饮料风味单一问题，研究人员通过传统诱变技术选育氨基酸高产酵母菌株。研究发现，通过解除Ilv1、Ilv6、Leu4等关键酶的反馈抑制（如Ilv1His480Tyr变异），以及调控Aro80转录因子功能，成功实现了支链氨基酸（BCAAs）和苯丙氨酸（Phe）的细胞内积累，显著提升了清酒、泡盛等饮品中2-甲基-1-丁醇、异丁醇等香气成分含量。该非转基因育种策略为食品工业风味调控提供了新范式。

　　

在酒精饮料的世界里，风味是灵魂。无论是清酒的"吟酿香"，啤酒的麦芽香，还是葡萄酒的果香，都离不开酵母在发酵过程中产生的挥发性化合物。这些迷人的香气大多源自氨基酸通过埃尔利希途径（Ehrlich pathway）的转化——支链氨基酸（BCAAs）生成香蕉、苹果般的酯香，苯丙氨酸（Phe）则转化为玫瑰般的2-苯乙醇。然而，酵母细胞天然的代谢调控机制如同精密的刹车系统，通过反馈抑制（feedback inhibition）严格限制着氨基酸的过量积累，制约了风味化合物的多样性。

更棘手的是，虽然基因工程技术能够精准改造代谢通路，但公众对转基因食品（GMOs）的接受度有限，尤其在日本等地区，这成为技术应用的"玻璃天花板"。如何在不动用外源DNA的前提下，培育出能丰富饮品风味的酵母菌株？这成为酿酒工业面临的关键挑战。

针对这一难题，奈良科学技术大学院大学的研究团队另辟蹊径，采用传统诱变（conventional mutagenesis）结合毒性氨基酸类似物筛选的策略，成功选育出多株氨基酸高产酵母。相关研究成果发表于《FEMS Yeast Research》，系统阐述了通过解除代谢调控实现风味增强的分子机制，并为非转基因育种提供了新思路。

研究主要运用了以下关键技术：首先采用化学诱变剂处理工业酿酒酵母（如清酒酵母Kyokai no.9、Kyokai no.7）；其次利用毒性氨基酸类似物（如O-甲基苏氨酸、对氟苯丙氨酸）进行抗性筛选；通过全基因组测序和靶向基因测序鉴定突变位点；结合酶活实验验证反馈抑制解除效果；最后通过小规模酿造实验评估风味化合物变化。所有实验均使用工业酿酒酵母菌株，未引入外源DNA。

异亮氨酸

研究团队从清酒酵母K9的O-甲基苏氨酸（OMT）抗性突变体中筛选到K9-I48菌株，其异亮氨酸（Ile）产量提升2.9倍。基因分析发现，Ilv1蛋白（苏氨酸脱氨酶）的His480Tyr突变是关键原因。该突变使Ilv1对Ile的反馈抑制不敏感，导致Ile积累并促进2-甲基-1-丁醇（2MB）及其乙酸酯的生成。清酒酿造实验证实，突变体酿造的清酒中2MB和2-甲基丁酸乙酯含量提升2-3倍，显著增强苹果、梨等果香。

缬氨酸

通过对清酒酵母K7进行诱变，获得缬氨酸（Val）高产菌株K7-V7。测序发现其Ilv6（乙酰羟酸合酶调节亚基）发生Ala31Thr杂合突变。酶学分析表明，该突变削弱了Val对酶的反馈抑制，使Val产量提高1.7倍。在实际清酒酿造中，突变体产生的异丁醇和异丁酸乙酯增加1.5倍，赋予饮品更突出的梨香和香蕉香气。

亮氨酸

为提升冲绳泡盛（awamori）的果香特征，研究团队从泡盛酿造酵母、木槿花和香蕉茎分离的野生酵母中选育亮氨酸（Leu）积累突变体。所有突变均集中在LEU4基因编码的α-异丙基苹果酸合酶（IPMS）上，如Ser542Phe、Ala551Val等位点突变。这些突变通过解除Leu对IPMS的反馈抑制，使Leu产量增加，进而提升3-甲基-1-丁醇（3MB）和3-甲基丁酸乙酯（香蕉香气主要成分）在泡盛中的含量。

苯丙氨酸

通过筛选对氟苯丙氨酸抗性突变体，获得苯丙氨酸（Phe）积累菌株K9-F39。全基因组测序发现Aro80转录因子发生His309Gln突变。功能实验表明，该突变体虽能结合ARO9和ARO10启动子，但丧失转录激活能力，从而抑制Phe降解途径。清酒酿造中突变体使Phe含量显著上升，但2-苯乙醇略有下降，说明通过调控Aro80可精确平衡Phe与其衍生物的比例。基于同一策略选育的啤酒酵母更成功商业化，生产出具有浓郁玫瑰香的精酿啤酒。

非转基因基因组编辑系统的开发

为突破传统诱变的随机性局限，团队开发了质粒游离CRISPR/Cas9系统。该系统通过直接转化核糖核蛋白（RNP）复合物实现基因编辑，避免外源DNA残留。实验证实，RNP与线性DNA供体共转化可高效引入点突变（如ILV2^T383I），编辑效率达21%。该技术为精准调控代谢通路（如芳香化合物合成途径）提供了非转基因工具，但需进一步解决编辑效率、社会接受度和专利壁垒等问题。

本研究通过多维度策略证明了传统诱变在酵母育种中的实用价值：一是阐明了关键代谢节点（Ilv1、Ilv6、Leu4、Aro80）的调控机制与风味形成的因果关系；二是建立了从实验室筛选到工业化应用的完整技术路径；三是开创了"氨基酸功能工程"新范式，将氨基酸积累与细胞保护、产物耐受等生理功能相关联。值得注意的是，研究中发现的突变位点（如Ilv1^His480Tyr）不仅适用于酒精饮料，还可拓展至香料、化妆品乃至生物燃料领域。

尽管质粒游离基因组编辑技术尚未成熟，但其与日本本土开发的Target-AID/nCas9等系统的结合，有望构建规避国际专利的非转基因编辑平台。随着法规框架的完善，这种精准育种策略或将成为食品工业绿色升级的关键推手——在不动用外源基因的前提下，让微生物为人类酿造更丰富、更健康的风味世界。