模型膜之间脂质转移的研究以及转运蛋白对脂质运输的影响

《ACS Omega》：Investigation of Lipid Transfer between Model Membranes and the Effect of a Transport Protein on Trafficking

磷脂交换机制与膜结合蛋白LetB的功能研究。采用合成脂质体平台，系统考察温度（4-37℃）、pH（6.5-9.5）及脂质浓度比对脂质转移速率的影响。结果表明：温度和pH对脂质交换影响有限，NBD-PG在37℃时转移率显著升高；自发交换主要通过脂质体碰撞实现。当LetB-ΔTM通过His6标签锚定于供体脂质体表面时，NBD-PE和NBD-PG转移效率分别提升至79%和82%，且存在蛋白-受体脂质体共沉淀现象。该研究揭示了膜结合蛋白在脂质跨膜转运中的关键作用，为癌症药物递送系统设计提供新思路。

　　生物膜的磷脂组成受到严格调控，微小的调整都会对膜的宏观性质以及与膜相关蛋白的重要功能产生显著影响。为了深入理解这一现象，科学家们研究了磷脂在膜之间的自发交换和由蛋白质催化的交换机制。这项研究构建了一个体外平台，用于分析标记的磷脂衍生物在合成脂质体之间的转移，并系统地探讨了溶液性质如温度、pH值和脂质体浓度对膜间磷脂交换的影响。此外，还研究了代表性磷脂转运蛋白的作用，以理解蛋白质浓度和膜锚定对磷脂转移的贡献。研究发现，当蛋白质与膜的相互作用通过锚定实现时，磷脂的自发交换会被显著增强，这表明膜结合蛋白可能在催化膜间磷脂转移过程中起着关键作用。

生物膜不仅由磷脂构成，还包含其他大分子，如膜结合或膜嵌入的蛋白质，这些蛋白质执行多种细胞生存所必需的功能。例如，周质膜蛋白通过复杂的静电和疏水界面与膜表面结合，而这些可逆相互作用的失调在癌症等疾病的发病过程中起着重要作用。而整合膜蛋白则贯穿整个生物膜，其功能高度依赖于周围的局部脂质环境。因此，膜磷脂的组成及其生物物理特性直接影响周质和整合膜蛋白的活性。膜间磷脂的动态变化有助于调节磷脂-磷脂和磷脂-蛋白质的相互作用，而磷脂在膜之间的转移通常是实现这些组成变化的重要机制。这一转移过程常由脂质转运蛋白介导，这些蛋白在真核细胞的膜接触位点中起着关键作用，最近被确认为癌症药物开发的新靶点。

为了进一步研究脂质转运蛋白在膜组成变化中的作用，本研究采用了大肠杆菌中的脂质转运蛋白LetB作为代表。LetB最初被鉴定为一种磷脂转运蛋白，属于哺乳动物细胞进入（MCE）蛋白家族。LetB蛋白含有一个N端跨膜（TM）螺旋，该螺旋锚定蛋白到大肠杆菌的内膜上，其后接有七个模块化的MCE结构域。LetB缺乏其N端TM螺旋的变体（LetB-ΔTM）被发现为六聚体结构，六个MCE结构域形成一个具有疏水内部通道的环。这些结构域堆叠起来形成约20纳米长的通道，足以跨越大肠杆菌膜之间的水相空间，并物理连接两个膜，从而将磷脂在膜之间转运，类似于真核细胞中的膜接触位点。

本研究建立了一个体外脂质转运实验平台，用于分析合成脂质体与含有大肠杆菌脂质的脂质体之间的脂质转运。该平台被用来系统研究溶液性质对脂质转运的影响，包括温度、pH值以及供体和受体脂质体的摩尔比例。此外，研究还引入了LetB-ΔTM蛋白，以探讨这种膜结合蛋白如何促进脂质在脂质体之间的转移。实验结果显示，在某些条件下，LetB-ΔTM对脂质转移的促进作用有限，这可能与LetB蛋白的结构灵活性或其N端TM螺旋的缺失有关。SDS-PAGE分析表明，LetB-ΔTM在这些测试条件下无法有效结合到脂质体上。

为了更好地模拟LetB-ΔTM在膜上的锚定作用，研究者将含有镍螯合头基的脂质（如DGS-NTA(Ni2?)）引入到供体和受体脂质体中。这种镍螯合头基能够与LetB-ΔTM的C端六组氨酸标签紧密结合。当LetB-ΔTM被锚定在供体脂质体上时，脂质转移显著增加，接近80%的标记磷脂（NBD-PE）被转移到受体脂质体中。然而，当LetB-ΔTM被锚定在受体脂质体上时，脂质转移并未显著增加。控制实验表明，供体和受体脂质体的大小和曲率对脂质转移的影响较小。进一步的共沉淀实验显示，His?-LetB-ΔTM锚定在供体脂质体后，能够与受体脂质体结合并促进脂质转移。而将His?-LetB-ΔTM锚定在受体脂质体上时，未能有效与供体脂质体结合，从而无法促进脂质转移。

为了验证LetB-ΔTM的锚定对脂质转移的具体影响，研究者在脂质转移实验后进行了蛋白酶水解。在蛋白酶处理后，供体和受体脂质体被分离，并对NBD荧光信号进行测量。结果显示，蛋白酶处理后，NBD-脂质显著转移到受体脂质体中，这表明LetB-ΔTM在脂质转移过程中起到了关键作用。这些数据表明，当LetB-ΔTM被锚定在供体脂质体上时，它能够有效地结合到受体脂质体并促进脂质转移，而当它被锚定在受体脂质体上时，其促进作用有限。

本研究的体外脂质转运实验平台能够有效区分自发脂质转移和由蛋白质催化的脂质转移机制。实验结果显示，自发脂质转移在温度和pH值变化时表现出较小的依赖性，表明温度引起的相变对脂质转移的影响有限。而通过锚定LetB-ΔTM到供体脂质体上，脂质转移效率显著提高，这表明蛋白质锚定在促进脂质转移过程中起着重要作用。这些发现为理解膜接触位点中脂质转运的分子机制提供了新的视角，并可能为相关疾病的治疗策略提供理论依据。

脂质转运蛋白在生物膜的维持中起着至关重要的作用。本研究探讨了大肠杆菌MCE蛋白LetB如何促进膜间的脂质交换。实验数据表明，LetB-ΔTM能够有效地将两种内源性大肠杆菌磷脂（PE和PG）转移至受体脂质体中，但其转移效率受到脂质-蛋白比例和脂质体锚定条件的影响。当LetB-ΔTM被锚定在供体脂质体上时，其促进脂质转移的能力显著增强，这可能与LetB的N端TM螺旋在维持脂质转运活性构象中的作用有关。而将LetB-ΔTM锚定在受体脂质体上时，其促进作用则不明显。这提示我们，膜结合蛋白在促进脂质转运中的作用可能与其在膜上的锚定方式密切相关。

此外，本研究还探讨了不同实验条件对脂质转移的影响。例如，供体和受体脂质体的摩尔比例变化对脂质转移效率有显著影响。当供体脂质体与受体脂质体的比例增加时，脂质转移的速率也随之增加。这表明，脂质转移可能依赖于供体和受体之间的物理接触，而非单纯的扩散过程。同时，研究还发现，当供体和受体脂质体在不同的pH值下进行实验时，脂质转移效率略有提高，但这种影响相对较小。这可能与磷脂头基的电离状态变化有关，但其对整体转移速率的影响有限。

本研究的实验平台为研究膜接触位点中脂质交换的分子机制提供了重要的工具。通过控制实验条件，如温度、pH值、脂质体浓度和蛋白质锚定方式，研究者能够系统地分析脂质转移的动态过程。这些数据不仅揭示了自发脂质转移的机制，还展示了蛋白质在促进脂质转移中的关键作用。特别是在锚定LetB-ΔTM到供体脂质体后，脂质转移效率显著提高，这可能与LetB的结构特性及其与膜的相互作用方式有关。未来的研究可以进一步探讨蛋白质催化的脂质转移机制，以及这些机制在不同生物系统中的应用潜力。

本研究的实验方法主要包括脂质体的制备、脂质转运实验和蛋白质纯化等步骤。脂质体的制备涉及将磷脂溶解于氯仿中，然后通过干燥和超声处理形成脂质膜。脂质转运实验则通过将标记的磷脂（如NBD-PE和NBD-PG）与不同条件下的脂质体混合，并在特定时间后进行离心分离，测量荧光信号以评估脂质转移的效率。蛋白质纯化过程包括表达、分离和鉴定LetB-ΔTM蛋白，并通过SDS-PAGE分析其分子量和纯度。为了验证LetB-ΔTM在脂质转移中的作用，研究者还进行了蛋白酶水解实验，以确保脂质转移是由蛋白质介导而非由其他因素引起。

总之，本研究通过构建一个体外实验平台，系统地分析了脂质在膜之间的自发转移和由蛋白质催化的转移机制。实验结果表明，脂质转移的效率受到多种因素的影响，包括温度、pH值、脂质体浓度和蛋白质锚定方式。此外，研究还揭示了LetB-ΔTM在促进脂质转移中的作用，特别是当其被锚定在供体脂质体上时，其促进作用显著增强。这些发现不仅加深了我们对膜间脂质转移机制的理解，还为相关疾病的治疗策略提供了新的思路。未来的研究可以进一步探讨这些机制在不同生物系统中的应用，以及如何利用这些知识开发新的药物和治疗方法。