结合阴离子转运和磷脂结合作用以提高二氨基咔唑类化合物的抗菌活性

《ACS Omega》：Combining Anion Transport and Phospholipid Binding for Improved Antibacterial Activity of Diamidocarbazoles

新型抗生素研究显示，杂双齿受体R4通过结合细菌膜中的磷脂乙二醇（PE）和转运阴离子协同作用，对多种革兰氏阳性菌（MIC≤4 μM）展现出高效抗菌活性，且对人体红血细胞无毒。

　　随着细菌对抗生素的耐药性不断上升，寻找新的抗生素靶点成为解决这一全球性健康问题的关键。传统抗生素主要通过抑制细菌蛋白质合成或干扰核酸复制等机制起作用，然而这些靶点在细菌中容易产生耐药性变异，导致抗生素的效力迅速下降。因此，科学家们开始探索更具选择性的靶点，如细菌细胞膜。细胞膜在维持细胞结构和功能中起着至关重要的作用，其组成和特性与哺乳动物细胞膜存在显著差异。这种差异为开发能够特异性作用于细菌膜而不会对哺乳动物细胞造成伤害的化合物提供了可能。

细菌细胞膜主要由磷脂组成，其中磷脂酰乙醇胺（PE）是许多革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌膜的重要成分。相比之下，哺乳动物细胞膜中以磷脂酰胆碱（PC）为主。由于PE和PC在分子结构上的不同，特别是PE中铵基的甲基化程度较低，使得某些合成分子能够优先与PE结合，而对PC无明显作用。这一特性为开发具有选择性的抗菌化合物奠定了基础。已有研究利用这一原理设计出能够靶向细菌PE的化合物，例如基于尿素的受体U1–U3，它们在一定条件下表现出良好的抗菌活性。然而，这些单功能受体在抗菌效力和选择性方面仍存在局限，特别是在低浓度下难以发挥显著作用。

为了克服这一限制，研究人员提出了一种新的策略，即开发具有双重功能的分子受体，既能结合细菌膜中的PE，又能促进跨膜离子转运。这种双功能受体有望在抗菌活性和细胞选择性之间取得更好的平衡，从而提高治疗效果并减少对哺乳动物细胞的毒性。基于这一设想，研究团队设计并合成了基于二氨基咔唑（diamidocarbazole）骨架的新型受体R2和R4，并与单功能受体R1和R3进行了比较。二氨基咔唑已被证实是高效的跨膜阴离子转运剂，且具有对氧阴离子（如磷酸盐）的高亲和力，使其成为结合离子转运与磷脂结合功能的理想候选分子。

在磷脂结合研究中，研究人员利用紫外-可见光谱（UV–vis）滴定实验评估了R1–R4对PE和PC的结合能力。实验结果显示，除了R4外，其他受体对PC的结合能力相近，而R4对PE表现出显著更高的亲和力。这表明R4能够通过其两个预组织的结合域，同时与PE中的磷酸盐和铵基结合，从而实现更高效的结合效果。这种双重结合能力可能是R4在抗菌活性方面优于其他受体的关键因素之一。此外，研究人员还通过DFT计算进一步验证了R4的结合机制，确认了其能够通过分子间作用力稳定地与PE结合。

在跨膜离子转运研究中，研究团队采用了一系列实验方法，包括基于Lucigenin的荧光测定和基于HPTS的pH梯度监测实验。Lucigenin是一种对氯离子（Cl?）敏感的荧光探针，当氯离子跨膜运输时，其荧光强度会发生显著变化。实验结果表明，R3在氯离子转运方面表现出最高的活性，而R4的转运速率虽然略低，但仍具有显著的抗菌能力。HPTS实验则通过监测pH梯度的变化来评估受体是否能够通过H?/Cl?对称转运或OH?/Cl?反向转运机制影响细胞膜电位。结果显示，R3主要通过氯离子转运起作用，而R4则能够通过结合PE头基和促进离子转运双重机制发挥抗菌效果。

在抗菌性能评估方面，研究人员采用标准的肉汤稀释法（broth microdilution）测定了R1–R4对多种细菌的最小抑菌浓度（MIC）。实验结果显示，R1–R3对革兰氏阴性菌如大肠杆菌（E. coli）没有明显的抗菌活性，而R4则表现出对革兰氏阳性菌的显著抑制作用。特别是对PE含量较高的枯草芽孢杆菌（B. cereus），R4的MIC值仅为4 μM，远低于已知的PE靶向抗生素duramycin（MIC约为32 μM）。这一结果表明，R4在抗菌活性方面具有明显优势。此外，R4还对其他革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌（S. aureus）和粪肠球菌（E. faecalis）表现出良好的抗菌效果，尽管这些菌种的PE含量较低。相比之下，R1和R3由于缺乏对PE的结合能力，仅对PE含量较低的菌种具有一定的抗菌活性。

在细胞毒性研究中，研究人员评估了R1–R4对人红细胞的溶血作用。结果表明，即使在接近1 mM的高浓度下，R4的溶血活性仍低于50%，说明其对哺乳动物细胞具有较低的毒性。这一特性对于开发安全有效的抗生素至关重要。相比之下，R1和R2的溶血活性较高，表明它们在高浓度下可能对红细胞造成损害。R3的溶血活性也相对较高，尽管其抗菌活性主要依赖于氯离子转运，但其对红细胞的毒性仍需进一步优化。

综上所述，这项研究成功开发了一种新型的双功能分子受体R4，该受体能够同时结合细菌膜中的PE并促进跨膜离子转运。这种双重功能的结合不仅提高了抗菌活性，还增强了对哺乳动物细胞的选择性，使其成为开发新一代膜靶向抗生素的有希望的候选分子。研究结果表明，结合磷脂结合与离子转运的策略在抗菌药物设计中具有重要的应用前景。然而，为了进一步优化这些化合物的抗菌效果并明确其作用机制，仍需进行更多的研究。未来的工作可能包括对R4在不同细菌种类中的具体作用机制的深入探讨，以及对其结构和功能的进一步修饰，以提高其抗菌效力和降低毒性。此外，还需要评估这些化合物在体内的稳定性、生物利用度以及潜在的临床应用价值。