基于表面等离子体共振（SPR）的工作流程，用于高效发现靶向CD28的小分子

《ACS Omega》：Surface Plasmon Resonance (SPR)-Based Workflow for High-Throughput Discovery of CD28-Targeted Small Molecules

表面等离子体共振（SPR）高通量筛选技术成功发现CD28靶向小分子抑制剂，其中DDS5通过氢键与Phe93结合，稳定抑制CD28-CD80相互作用，并获分子动力学验证。SPR平台为复杂蛋白-小分子相互作用研究提供高效方案。

　　CD28是一种在T细胞激活和免疫调节中起关键作用的共刺激受体，其作为免疫调节治疗的靶点具有重要价值。然而，尽管其在治疗上的重要性日益凸显，针对CD28的小分子抑制剂仍处于探索阶段。为填补这一研究空白，我们开发了一种基于表面等离子体共振（SPR）的高通量筛选（HTS）工作流程，以识别新的针对CD28的小分子药物。据我们所知，这是首个应用于发现针对刺激性免疫检查点受体的小分子药物的SPR基筛选平台。我们使用了一种包含1056种小分子的化学库，在384孔板格式下进行了筛选，最终获得了12个初步的命中化合物（命中率1.14%）。随后的剂量反应SPR筛选确认了其中三种化合物具有微摩尔范围内的结合亲和力。通过分子对接和100纳秒的分子动力学（MD）模拟，我们进一步研究了最显著的命中化合物DDS5与CD28的结合机制，发现其在CD28上形成了稳定的复合物，结合方式主要依赖于氢键作用以及与Phe93的持续相互作用。功能性验证通过竞争性ELISA实验确认了DDS5对CD28与CD80相互作用的抑制效果。这些结果表明，我们的基于SPR的筛选平台为发现针对CD28的小分子药物提供了一种稳健且高效的方法。将计算评估与多种验证方法相结合，进一步凸显了DDS5作为早期免疫调节剂的潜力。

T细胞激活是一个高度调控的过程，需要抗原识别和共刺激信号的双重作用。在众多关键的共刺激受体中，CD28在启动和维持T细胞反应中起着核心作用。当缺乏CD28信号时，仅靠T细胞受体（TCR）的激活可能导致T细胞无反应（anergy）、凋亡或向调节性T细胞分化，这些机制对于维持外周耐受和防止自身免疫至关重要。CD28在初始T细胞中持续表达，并与抗原呈递细胞（APCs）上的经典配体CD80（B7-1）和CD86（B7-2）相互作用。这种相互作用通过促进下游通路如PI3K-Akt、NF-κB和MAPK的激活，增强了白细胞介素-2（IL-2）的产生、细胞周期进程和抗凋亡反应。CD28信号的失调已被证实与多种免疫介导疾病的发生发展有关，例如炎症性肠病和类风湿性关节炎。因此，针对CD28的治疗策略主要集中在生物大分子上，如单克隆抗体和Fc融合蛋白，这些药物通过阻断配体结合和下游信号传导来抑制过度的T细胞激活，从而在慢性炎症状态下恢复免疫平衡。尽管这些基于蛋白质的治疗方法在某些情况下表现出疗效，但它们也伴随着一些局限性，如免疫原性、组织穿透能力有限以及复杂的生产过程。此外，生物大分子的全身性作用可能导致脱靶效应和长期免疫抑制，这促使了对更具有选择性和可控性的治疗替代方案的需求。

相比之下，小分子抑制剂具有多种优势，包括口服生物利用度、可调节的药代动力学特性和较低的抗药物抗体形成风险。然而，CD28靶向的小分子调节剂的开发一直受到蛋白-蛋白相互作用（PPI）界面固有结构和生物物理特性的阻碍。这些界面通常具有浅层、灵活且结合位点不明确的特征，这限制了小分子实现高亲和力和特异性结合的能力。近年来，生物物理筛选技术的进步为PPI靶向的小分子调节剂的发现提供了新的可能性。其中，表面等离子体共振（SPR）作为一种无需标记的高效技术，能够实时检测分子相互作用，具有高灵敏度和高通量的特性。SPR特别适合于研究如免疫检查点受体这类复杂的靶点，因为它允许在接近生理的溶液相条件下直接测量结合动力学和亲和力。此外，SPR与碎片和多样性导向的化学库的兼容性，使其成为针对传统难以成药靶点的早期识别的理想平台。

为了满足对CD28小分子调节剂的未满足需求，我们开发了一种基于SPR的高通量筛选平台。使用该平台，我们对一组结构多样的小分子化合物进行了筛选，最终识别出多个命中化合物（命中率1.14%）。其中，三种化合物表现出微摩尔范围内的结合亲和力。我们进一步分析了这些化合物与CD28的结合模式，并评估了其对CD28-CD80相互作用的抑制潜力。通过分子对接和分子动力学模拟，我们发现DDS5能够稳定地结合到CD28的特定区域，并通过空间位阻机制干扰配体的结合。这些发现不仅支持了DDS5作为免疫调节剂的潜力，也为后续的结构-活性关系（SAR）研究和先导化合物优化提供了理论依据。

我们采用的SPR基筛选方法在溶液相条件下实现了对分子相互作用的直接、实时检测，这是传统HTS方法难以实现的。SPR的高灵敏度和高特异性使得我们能够有效区分真正的结合分子和非特异性相互作用，从而减少假阳性的出现。相比之下，其他HTS平台如微尺度热泳技术，由于依赖间接检测和缺乏动力学信息，假阳性率较高。因此，我们的方法为筛选结构复杂的PPI靶点如CD28提供了一种更可靠的选择。此外，SPR技术的低样品消耗和广泛的分子兼容性使其在片段导向设计、作用机制研究和选择性分析中不可或缺。

我们发现的命中化合物中，DDS5表现出了最强的结合亲和力，并且在分子动力学模拟中保持了与CD28的稳定结合。这种稳定结合不仅体现在结合位点的持续相互作用，还通过与Phe93的持久作用得到了验证。这些结果表明，DDS5能够有效干扰CD28与CD80的结合，为小分子药物在免疫调节中的应用提供了新的方向。此外，多个命中化合物共享一个1,4取代的1,2,3-三唑基团，这一结构特征在多种蛋白质和PPI抑制剂中较为常见。尽管三唑基团在药物研发中被广泛使用，但尚未有报道将其用于CD28的调节。因此，这些化合物的发现不仅具有新颖性，也为后续的优化研究提供了宝贵的起点。

本研究的结论表明，我们成功地实现了首个针对CD28的基于SPR的高通量筛选平台，这一成果为小分子药物在免疫检查点调节中的应用开辟了新的可能性。通过结合SPR技术、计算建模和功能验证，我们建立了一种全面的策略，用于早期筛选阶段的命中分子识别和评估。我们的研究不仅验证了CD28作为小分子药物靶点的可行性，还为未来的结构-活性关系研究和先导化合物优化提供了理论支持。此外，SPR技术的广泛应用为其他共刺激通路如ICOS的研究提供了新的思路，并可以整合到多靶点药物发现的流程中，以应对复杂的免疫相关疾病。通过证明CD28在小分子药物调控下的可成药性，本研究为免疫检查点生物学的化学调控拓展了新的边界，具有重要的科学和临床意义。