间充质干细胞外泌体通过OSKM调控逆转神经衰老的新机制

《Cell Communication and Signaling》：Mesenchymal stem cell derived extracellular vesicles reverses neural aging via OSKM modulation

本研究针对神经衰老这一关键医学问题，系统探讨了人胎盘来源间充质干细胞（hpMSCs）及其外泌体（hpEVs）通过调控TLR4信号通路和OSKM（OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC）多能转录因子，逆转神经衰老的分子机制。研究证实hpMSCs多次输注可显著改善老年小鼠的认知功能和运动能力，并发现hpEVs中富含的miRNA（如hsa-miR-92a-3p）可通过抑制TLR4信号通路，重新激活OSKM表达，从而延缓神经前体细胞衰老。该研究为干细胞外泌体治疗年龄相关神经退行性疾病提供了新的理论依据和治疗策略。

　　

随着全球人口老龄化加剧，神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）和帕金森病（Parkinson's disease, PD）的发病率逐年攀升，给社会带来沉重负担。衰老是这些疾病最主要的危险因素，其特征是生理功能逐渐衰退，伴随细胞衰老、干细胞功能下降以及慢性炎症等分子改变。尽管科学家已尝试多种干预策略，如调节免疫反应、清除衰老细胞或输注年轻血液，但在逆转神经衰老方面仍面临巨大挑战。

近年来，干细胞疗法在多种退行性疾病中展现出潜力。有趣的是，移植的干细胞往往无需完全替代受损组织即可发挥治疗作用，提示干细胞释放的活性因子可能起关键作用。人胎盘来源间充质干细胞（human placenta-derived mesenchymal stem cells, hpMSCs）因其来源丰富、免疫原性低等优势，成为再生医学的研究热点。然而，系统注射hpMSCs及其分泌物对正常衰老的影响尚不明确。

在此背景下，Kim等人在《Cell Communication and Signaling》上发表的研究，首次揭示了hpMSCs来源的外泌体（extracellular vesicles, EVs）可通过调控OSKM多能转录因子，逆转神经衰老进程。研究人员发现，hpEVs中富含的微小RNA（microRNAs, miRNAs）能够抑制Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）信号通路，进而上调OSKM（尤其是SOX2）的表达，重新激活衰老的神经前体细胞，改善老年动物的认知和运动功能。

为验证这一假说，研究团队采用多学科技术手段：通过静脉重复注射hpMSCs至18-19月龄老年雌性小鼠，评估其生存率、行为学表现（包括莫里斯水迷宫、 locomotion test、pole test等）；利用RNA测序分析海马组织基因表达谱；从hpMSCs培养上清中分离并鉴定外泌体（采用qEV尺寸排阻色谱法、纳米颗粒追踪分析、透射电镜和Western blot）；建立人胎儿神经前体细胞（human fetal neural progenitor cells, hfNPCs）衰老模型，通过共培养和hpEVs处理，评估细胞衰老标志物（如p16^INK4a、p19^INK4d、p21^CIP1）及OSKM表达变化；采用小RNA测序分析hpEVs中miRNA组成，并通过miRNA mimic转染和TLR4通路抑制剂（CLI-095、BX-795）处理，探讨分子机制；利用细胞穿透肽（cell-penetrating peptide, CPP）复合物将OSKM基因（如OCT4、SOX2）质粒装载至hpEVs，验证基因传递功能。

hpMSCs多次输注改善老年小鼠生存率和认知功能

研究显示，老年小鼠接受三次hpMSCs输注后，生存率显著提升（图1B）。行为学测试表明，经治疗的老年小鼠在莫里斯水迷宫实验中寻找平台的时间缩短（图1C），穿越平台次数增加（图1D），在目标区域停留时间延长（图1E），空间记忆明显改善。同时， locomotion test和pole test结果证实其运动协调性恢复至年轻小鼠水平（图1H-L）。这些结果提示hpMSCs可有效缓解年龄相关的认知和运动功能衰退。

hpMSCs下调海马衰老及相关基因表达

分子水平分析显示，老年小鼠海马组织中衰老标志物p16^INK4a、HMGA2a和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达显著升高，而hpMSCs治疗可逆转这一趋势（图2A-C）。同时，抗氧化基因SOD2和CAT在老年组上调，hpMSCs处理使其恢复至年轻水平（图2D-F），提示hpMSCs可能通过减轻氧化应激保护海马神经元。在细胞实验中，与hpMSCs共培养可降低衰老hfNPCs中p16^INK4a、p19^INK4d和p21^CIP1的表达（图2G-I），证实hpMSCs通过旁分泌作用抑制细胞衰老。

RNA测序揭示神经功能相关通路激活

基因本体（Gene Ontology, GO）和KEGG通路分析显示，老年小鼠海马中免疫炎症相关通路激活，而突触活动和信号传导基因受抑制。hpMSCs治疗后可上调增殖、脑发育、生物合成和代谢相关基因（表1）。差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析进一步证实，hpMSCs增强钙信号、唾液分泌、血清素能突触等神经信号通路（表2），提示其通过多途径改善神经功能。

hpEVs表征及其抗衰老作用

从hpMSCs培养上清分离的hpEVs呈典型杯状形态，直径约148.5纳米，表达CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101等外泌体标志物（图3A-C）。用hpEVs处理衰老hfNPCs可降低p19^INK4d、p21^CIP1和p53表达（图3D），并诱导抗氧化基因（SOD1、SOD2、CAT）和NRF2表达（图3E）。PKH26标记实验显示hpEVs可附着于hfNPCs膜表面（图3F），而palm-tdTomato标记的hpEVs在老年小鼠脑组织中检测到，且与CD63共定位（图3G），证实hpEVs可穿过血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）递送活性 cargo。

hpEVs中miRNA调控TLR4信号通路

小RNA测序发现hpEVs中富含18种主要miRNA（如hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-21-5p），其靶基因富集于衰老、炎症、脑功能及TLR4信号通路（图4A-B）。TLR4在衰老hfNPCs中表达升高，hpEVs处理可显著抑制其表达（图4C）。转染hsa-miR-92a-3p mimic可有效下调TLR4（图4D），生物信息学分析显示该miRNA与TLR4 mRNA靶向结合（图4E），并降低p16^INK4a和p19^INK4d表达（图4F）。

hpEVs通过TLR4-miRNA轴激活OSKM表达

衰老hfNPCs中OSKM（尤其是SOX2、OCT4、C-MYC）表达下降，而hpEVs处理可诱导其重新表达（图5A-B）。hpEVs治疗还能促进衰老hfNPCs形成神经球（图6），恢复干细胞特性。miR-92a mimic转染可上调SOX2、C-MYC和KLF4（图5C）。机制上，TLR4激活通过MyD88-IRAKs和TRIF-TBK1通路促进炎症并抑制RBBP5介导的OSKM表达（图5D）。TLR4抑制剂CLI-095可降低衰老基因表达（图5E），而TBK1抑制剂BX-795则诱导OSKM和RBBP5上调（图5F）。此外，CPP辅助的hpEVs可成功递送OCT4或SOX2质粒至hfNPCs，并激活内源性OSKM表达（图5G-I）。

本研究系统阐明了hpMSCs及其外泌体逆转神经衰老的双重机制：一方面，hpEVs中富含的miRNA（如hsa-miR-92a-3p）通过靶向抑制TLR4信号通路，解除对OSKM表达的抑制；另一方面，hpEVs可直接携带OSKM mRNA，促进多能转录因子表达。这两种作用共同促使衰老神经前体细胞重新激活，改善老年动物的认知和运动功能。

该研究的创新点在于首次揭示干细胞外泌体可通过调控TLR4-OSKM轴逆转神经衰老，为理解干细胞旁分泌效应提供了新视角。同时，研究证实衰老个体血脑屏障通透性增加，有利于外泌体脑内递送，这为开发无细胞治疗策略奠定了理论基础。尽管OSKM上调与功能改善相关，但二者因果关系仍需通过基因敲除等实验进一步验证。

总之，该研究不仅深化了对干细胞抗衰老机制的认识，还为治疗年龄相关神经退行性疾病提供了新的候选分子和策略，具有重要的科学意义和临床转化价值。