化学小分子直接重编程人成纤维细胞为具有强抗炎功能的间充质干细胞

《Stem Cell Research & Therapy》：Chemical direct conversion of human fibroblasts to mesenchymal stem cells that can alleviate inflammation in vivo

本研究针对自体间充质干细胞(MSC)移植治疗存在的取材创伤大、体外扩增易衰老等问题，开发了一种使用TGF-β受体抑制剂(ALK5iII)、ROCK抑制剂(Fasudil)和ATM抑制剂(KU-60019)组合，将人真皮成纤维细胞(HDF)直接转化为具有多向分化潜能和强大抗炎功能的化学诱导直接重编程间充质干细胞(cdMSC)。该cdMSC在体外展示典型MSC表面标志物(CD44/CD73/CD90/CD105/CD140b)，具备成骨/成软骨/成脂三系分化能力；在LPS诱导急性肺损伤和SKG小鼠自身免疫性关节炎模型中，cdMSC移植显著缓解炎症反应，其分泌的外泌体(cdMSC-exo)可促进巨噬细胞M2型极化。该研究为炎症性疾病再生医学提供了安全高效的新型细胞来源。

　　

在再生医学领域，间充质干细胞(MSC)因其多向分化潜能和强大的免疫调节功能，被视为治疗炎症性疾病的明星细胞。然而，传统自体MSC获取需通过侵入性操作从骨髓或脂肪组织采集，不仅给患者带来痛苦，更面临供者年龄影响细胞活性、体外扩增导致干细胞特性丧失等严峻挑战。这些局限性严重制约了MSC临床应用的推广。能否找到一种更安全、更便捷的MSC获取方式？这成为研究者们亟需破解的难题。

日本京都府立大学医学部免疫学教研室的山本健太( Kenta Yamamoto)团队另辟蹊径，将目光投向易于获取的人真皮成纤维细胞(HDF)。在发表于《Stem Cell Research & Therapy》的最新研究中，他们成功开发出仅用三种化学小分子组合，即可将HDF直接重编程为功能完善的MSC样细胞的新方法，为炎症性疾病治疗提供了突破性解决方案。

关键技术方法

研究以45岁女性来源的HDF为主要对象，使用TGF-β受体抑制剂(ALK5iII)、ROCK抑制剂(Fasudil)和ATM抑制剂(KU-60019)组合进行诱导。通过流式细胞术检测MSC表面标志物，RNA测序分析基因表达谱，体外三系分化实验验证多向分化能力。采用LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型和SKG/Jcl自身免疫性关节炎模型评估体内抗炎效果，通过纳米粒子追踪分析和巨噬细胞共培养实验表征外泌体功能。

化学组合诱导HDF获得MSC表型

研究人员发现，三种化合物协同作用可最有效诱导HDF表达典型MSC表面标志物。如^图1所示，与原始HDF相比，AKF处理后的细胞(cdMSC)的CD44、CD73、CD90、CD105和CD140b表达显著上调，甚至诱导了HDF原本不表达的CD34、CD146和CD271。这种表面标志物谱与脂肪组织来源MSC(ATMSC)、骨髓来源MSC(BMMSC)等多种天然MSC高度相似。

cdMSC具备多向分化能力

研究团队进一步验证了cdMSC的功能特性。如^图2所示，经成骨诱导后，cdMSC表现出高碱性磷酸酶(ALP)活性和钙结节形成能力；成脂诱导后产生大量脂滴；成软骨诱导后分泌丰富的蛋白聚糖。这些分化能力与ATMSC相当，而原始HDF几乎不具备这些特性。值得注意的是，AKF三药组合的分化诱导效果显著优于单药或双药组合。

基因组和表观遗传学重塑

RNA测序分析揭示了重编程过程的分子机制。如^图3所示，cdMSC与HDF之间有3679个基因表达存在显著差异，其中EIF4A1、MIF、TNMD和CD200等与干细胞特性和抗炎功能相关的基因显著上调。基因集富集分析(GSEA)显示"干细胞群体维持"、"中胚层发育"等通路显著富集。同时，CD34和CD140b基因上游区域的CpG甲基化水平降低，表明化学重编程伴随表观遗传学修饰的改变。

体外功能验证

如^图4所示，cdMSC在三系分化实验中均表现出与ATMSC相当的能力：成骨诱导后ALP活性和钙化结节形成增加；成脂诱导后脂滴积累明显；成软骨诱导后蛋白聚糖分泌旺盛。迁移实验表明cdMSC的迁移能力显著优于原始HDF，且能抑制THP-1细胞产生IL-1β，显示出抗炎潜力。

缓解急性肺损伤

在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中，cdMSC移植展现出强大的治疗潜力。如^图5所示，与PBS或HDF移植组相比，cdMSC移植显著减轻了肺泡充血、中性粒细胞浸润和肺泡壁增厚等病理改变。肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子基因表达显著降低，而抗炎因子TGF-β表达升高。支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞数量和炎症因子浓度也明显减少，效果与ATMSC移植相当。

治疗自身免疫性关节炎

在SKG/Jcl小鼠自身免疫性关节炎模型中，cdMSC同样表现出色。如^图6所示，cdMSC移植显著降低了关节炎评分，减轻了关节肿胀和骨破坏。组织学分析显示cdMSC治疗组关节炎症评分显著改善，炎症细胞浸润减少。流式细胞术分析发现cdMSC移植恢复了脾脏中Th17/Treg平衡，这可能是其缓解自身免疫的重要机制。体内成像显示cdMSC能够归巢至炎症关节部位并滞留至少7天。

外泌体介导抗炎机制

研究人员进一步探索了cdMSC发挥作用的分子机制。如^图7所示，cdMSC分泌的外泌体(cdMSC-exo)直径约155.6±34.7nm，表达典型外泌体标志物CD9和CD81。功能实验表明，cdMSC-exo可被巨噬细胞有效摄取，并显著抑制LPS/IFN-γ诱导的M1型极化(降低IL-6和TNF-α产生)，同时促进IL-4诱导的M2型极化(上调MRC-1和IDO-1表达)。这种免疫调节功能与ATMSC-exo相当，而HDF-exo无此效果。

研究结论与意义

该研究首次证实了仅用化学小分子组合即可将人成纤维细胞直接重编程为功能完善的MSC样细胞。cdMSC不仅具备典型MSC的表面标志物和多向分化能力，更在急慢性炎症疾病模型中展现出与天然MSC相当的强大治疗作用。其作用机制至少部分通过外泌体介导的巨噬细胞极化调控实现。

这项研究的突破性意义在于：首先，建立了无需基因转导的MSC诱导新方法，避免了外源基因插入致瘤风险；其次，cdMSC可从易获取的皮肤成纤维细胞产生，解决了自体MSC来源受限问题；第三，cdMSC-exo的发现为无细胞治疗提供了新思路。该技术平台不仅为炎症性疾病再生医学提供了安全、经济的新型细胞制剂，更为理解细胞命运决定的化学重编程机制提供了重要见解。