综述：CRISPR介导的间充质基质/干细胞工程——再生医学和癌症治疗免疫学应用近期进展总结

《Stem Cell Research & Therapy》：CRISPR-mediated engineering of mesenchymal stromal/stem cells: a summary of recent progress in immunological applications for regenerative medicine and cancer therapy

本综述系统阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术如何革新间充质基质/干细胞（MSC）的工程化改造，以增强其免疫学疗效。文章重点探讨了通过敲除β2-微球蛋白（β2M）降低免疫原性、利用CRISPR激活（CRISPRa）增强抗炎介质（如IL-10、TSG-6）分泌、靶向促炎通路（如TLR4/NF-κB）等关键策略。此外，综述还展望了工程化MSC在重塑肿瘤微环境（TME）和对抗细菌感染方面的应用潜力，尽管面临脱靶效应等挑战，CRISPR定制的MSC仍为克服类风湿性关节炎、癌症等疾病的免疫屏障提供了变革性策略。

　　

克服免疫原性和免疫排斥：工程化“免疫隐身”MSC

MSC的临床应用因其免疫原性和异质性受到限制。CRISPR/Cas9技术通过精确遗传修饰，为创建“免疫隐身”MSC以逃避宿主免疫监视提供了变革性手段。核心策略之一是靶向敲除β2-微球蛋白（β2M），即主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的关键轻链。研究表明，CRISPR介导的β2M缺失可显著降低人脐带MSC（UMSC）或诱导多能干细胞（iPSC）来源MSC的HLA I类分子表面表达，从而抑制CD8⁺ T细胞的活化和增殖，增强细胞存活和植入。例如，在心脏修复模型中，β2M敲除的UMSC有效减少了IFN-γ和TNF-α等促炎因子，改善了心脏功能。此外，协同敲除共刺激分子（如CD80/CD86）或采用核糖核蛋白（RNP）复合物等非病毒递送方法，可进一步提升编辑效率并减少免疫反应，为通用型“现货”疗法的开发铺平道路。

增强MSC固有的抗炎和免疫调节能力

增强抗炎细胞因子和蛋白质分泌

CRISPR技术能够显著增强MSC的抗炎输出。例如，通过CRISPRa上调骨髓来源MSC的白细胞介素-10（IL-10）表达，在糖尿病心肌梗死模型中可大幅降低心脏组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1水平，并减少CD68⁺/CD11b⁺炎症细胞浸润，从而改善心功能。另一项研究利用CRISPRa激活TNF-α刺激基因6（TSG-6），使MSC来源的细胞外囊泡（EV）携带更强的抗炎 cargo，在椎间盘退变模型中有效抑制了IL-1β诱导的IL-8和COX-2表达。

靶向炎症信号通路

CRISPR/Cas9可精确调控MSC内部的炎症信号。例如，通过敲除Keap1基因解除其对核因子E2相关因子2（Nrf2）的抑制，可增强脂肪来源MSC（AD-MSC）的抗氧化应激能力。另一研究通过敲除Toll样受体4（TLR4），显著降低了MSC的NF-κB信号活化和促炎因子（如IL-6、TNF-α）分泌，在心肌梗死模型中注射TLR4敲除的MSC后，小鼠存活率提高，心脏纤维化减轻，功能改善。

表观遗传重编程以获得免疫豁免表型

CRISPR还可用于表观遗传调控。例如，通过CRISPRa上调miR-2861来抑制组蛋白去乙酰化酶4/5（HDAC4/5），可塑造MSC的免疫豁免表型，增强其免疫调节能力，并在炎症条件下保持功能。

重新规划MSC用于有效的抗肿瘤免疫治疗

消除免疫抑制能力

在肿瘤微环境中，MSC的免疫抑制特性可能促进肿瘤进展。因此，CRISPR被用于逆转这一特性。例如，敲除程序性死亡配体1（PD-L1）可解除MSC对T细胞的抑制，增强IFN-γ分泌和抗肿瘤免疫反应。研究显示，PD-L1敲除的沃顿胶MSC及其来源的外泌体均丧失了对T细胞活化的抑制能力，恢复了Zap-70和Syk磷酸化等关键信号。

调节肿瘤微环境和免疫细胞运输

通过CRISPR敲除MSC中的CXCL12或CCL2等趋化因子，可改变肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化方向，使其从促瘤的M2型向抗瘤的M1型转变，从而抑制肿瘤生长。例如，CCL2敲除的MSC与前列腺癌细胞共注射后，减少了巨噬细胞向肿瘤的募集，并增强了抗肿瘤单核细胞（CD45⁺CD11b⁺Ly6G^–）浸润，显著抑制了肿瘤发展。

智能疗法与反馈控制的免疫调节

创新方法包括为MSC装备反馈控制系统。例如，利用CRISPR/Cas9质粒工程化人脐带MSC（hUC-MSC），使其在TNF-α升高时自调节分泌可溶性TNF-α受体1（sTNFR1）。这些MSC来源的、带有靶向肽的EV能在脊髓损伤部位积累，中和TNF-α，减轻炎症并促进神经再生，实现了局部、按需的免疫调节。

其他CRISPR相关的MSC功能增强

抗菌与组织修复

CRISPRa上调CD14表达可增强MSC对脂多糖（LPS）的识别和反应速度，提升其抗菌能力。另一方面，通过rAAV6介导的CRISPR/Cas9系统使人间充质干细胞稳定过表达血小板衍生生长因子B（PDGF-B），在糖尿病伤口模型中显著加速了血管新生和伤口愈合。

挑战与展望

尽管前景广阔，CRISPR工程化MSC的临床转化仍面临挑战，包括脱靶效应、长期基因组稳定性、安全高效的递送方法以及复杂的监管框架。未来研究需优化基因编辑精度，开发更复杂的反馈控制系统，并探索联合疗法。在肿瘤治疗中，消除免疫抑制特性（如PD-L1敲除）的策略与在移植中增强免疫豁免（如β2M敲除）的目标存在概念上的对立，凸显了应用需结合疾病背景。尽管多数证据来自临床前研究，且缺乏独立验证和长期人体数据，但CRISPR/Cas9无疑为下一代MSC疗法奠定了坚实基础，推动其向精准医疗迈进。