miR-185缺失通过ARL8B-RAB5A互作增强骨细胞网络连接性并抑制骨质疏松的新机制

《Stem Cell Research & Therapy》：Depletion of mmu-miR-185 enhances osteocyte connectivity and suppresses bone fragility through the interaction between ARL8B and RAB5A

本研究针对雌激素缺乏导致的骨质疏松中骨细胞网络损伤这一关键问题，通过构建miR-185基因敲除小鼠和细胞模型，首次揭示了miR-185通过靶向调控ARL8B-RAB5A相互作用，影响ITGB1内吞循环和FAK信号通路，从而维持骨细胞树突形态完整性的分子机制。研究发现不仅阐明了骨细胞网络形成的新调控通路，还为骨质疏松治疗提供了新的潜在靶点。

　　

骨骼作为人体最大的器官系统，约占体重的20%，不仅为身体提供支撑和保护，还通过骨重塑维持矿物质稳态。在这个精密的系统中，骨细胞作为最丰富的细胞类型，占成人骨骼细胞的95%以上。这些细胞深埋于矿化骨基质中，通过复杂的树突网络——骨细胞陷窝-小管网络（LCN）相互连接，形成类似神经网络的通讯系统。骨细胞通过这个网络感知机械刺激和激素信号，调控成骨细胞和破骨细胞活性，从而维持骨稳态平衡。

然而，在骨质疏松等骨骼疾病中，这个精密的网络常常遭到破坏。特别是绝经后女性，由于雌激素水平急剧下降，骨细胞网络连接性显著降低，导致骨脆性增加，骨折风险升高。随着人口老龄化加剧，骨质疏松性骨折的发生率预计在未来十年将上升25%，给社会带来沉重的经济负担。尽管骨细胞网络的重要性日益凸显，但调控其形成的分子机制尚不完全清楚。

近年来，微小RNA（miRNA）作为重要的基因表达调控因子，在骨稳态中发挥着关键作用。其中，miR-185被发现在骨代谢中具有重要功能，但其在骨细胞中的具体作用机制仍有待探索。为了解决这一科学问题，崔雅琪等研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了最新研究成果。

研究人员主要采用了基因编辑技术构建miR-185敲除模型，包括利用CRISPR/Cas9技术构建miR-185敲除（KO）小鼠和MLO-Y4骨样细胞系。通过双侧卵巢切除术（OVX）建立雌激素缺乏诱导的骨质疏松模型，采用微型计算机断层扫描（micro-CT）评估骨微结构，三点弯曲试验检测骨生物力学性能。在分子机制研究方面，运用了免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、双荧光素酶报告基因检测、细胞表面蛋白生物素化等技术，并结合细胞三维（3D）培养模型模拟体内环境。

Fig.1 Knockout of mmu-miR-185 enhances bone mechanical properties by strengthening osteocyte LCN interconnectivity and attenuates bone loss caused by ovariectomy(OVX)

研究发现在miR-185 KO的OVX小鼠中，骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th）均显著改善，而骨表面积/骨体积（BSA/BV）和骨小梁间距（Tb.Sp）降低。Ploton银染色显示KO OVX小鼠骨细胞小管数量和长度均优于WT OVX组，三点弯曲试验证实miR-185 KO显著改善了骨的力学性能。

Fig.2 Knockdown of mmu-miR-185 promotes dendrites formation in MLO-Y4 cells, accelerating cell maturation

在细胞水平上，miR-185 KO的MLO-Y4细胞表现出更复杂的树突分支和更长的树突长度，扫描电镜和三维培养结果均证实了这一现象。CCK-8实验显示miR-185 KO细胞的增殖能力下降，表明其更接近成熟骨细胞状态。

Fig.3 miR-185 knockout directly targets Arl8b, altering its expression and localization

机制研究发现ARL8B是miR-185-5p的直接靶基因。双荧光素酶报告基因实验证实miR-185-5p通过结合Arl8b的3'UTR区域调控其表达。在miR-185 KO细胞中，ARL8B的mRNA和蛋白表达均上调，且其细胞内定位从核周区重新分布到细胞周边和树突中。

Fig.4 ARL8B enhances dendrite arborization in MLO-Y4 cells

功能实验表明，敲低ARL8B显著抑制了骨细胞树突形成，而过表达ARL8B则促进树突分支复杂性。这些结果证实ARL8B是维持骨细胞树突形态的关键分子。

Fig.5 ARL8B interacts with RAB5A to enhance dendrite branching and maintenance

研究人员进一步发现ARL8B与RAB5A存在直接相互作用。免疫共沉淀和GST pull-down实验证实了二者的结合。miR-185 KO增强了ARL8B与RAB5A的共定位，而敲低RAB5A同样损害了骨细胞连接性。

Fig.6 ARL8B facilitates RAB5A-mediated endocytic recycling of ITGB1 while suppressing its lysosomal entry, consequently enhancing ITGB1 protein levels

深入机制研究表明，ARL8B通过促进RAB5A介导的ITGB1内吞循环，抑制其进入溶酶体降解，从而维持ITGB1蛋白水平。细胞表面蛋白生物素化实验显示，敲低ARL8B显著降低了ITGB1的循环效率。

Fig.7 Knockout miR-185 enhanced ARL8B expression, leading to elevated ITGB1 levels and subsequent activation of the ITGB1-FAK signaling pathway

Western blot分析显示miR-185 KO提高了ITGB1和磷酸化FAK（p-FAK）水平，而敲低ARL8B则抑制了FAK活化。过表达RAB5A可以挽救ARL8B敲低引起的ITGB1-FAK信号抑制。

Fig.8 The expression of ARL8B is regulated by estrogen, and the blockage of miR-185 in MLO-Y4 cells induces osteoblast mineralization

研究发现雌激素正调控ARL8B表达，而OVX降低了原代骨细胞中ARL8B水平。条件培养基实验表明，miR-185 KO的MLO-Y4细胞条件培养基显著促进成骨细胞矿化，上调成骨标志物表达。

Fig.9 Depletion of miR-185 in MLO-Y4 cells reduces the osteoclastogenic potential of RAW264.7 cells

ELISA检测显示miR-185 KO小鼠血清和MLO-Y4细胞条件培养基中可溶性RANKL（sRANKL）水平降低，骨保护素（OPG）水平升高。TRAP染色和qPCR分析证实miR-185 KO条件培养基抑制破骨细胞分化，而ARL8B敲低则促进破骨形成。

本研究系统阐明了miR-185在骨细胞网络形成和骨质疏松进展中的关键作用。研究发现miR-185通过靶向ARL8B-RAB5A-ITGB1-FAK信号轴，精密调控骨细胞树突形态和网络连接性。在雌激素缺乏条件下，miR-185表达上调抑制了这一通路，导致骨细胞网络损伤和骨质量下降。而miR-185缺失则通过维持骨细胞网络完整性，改善骨生物力学性能，同时通过调节骨细胞旁分泌功能，促进成骨细胞矿化并抑制破骨细胞分化。

该研究的创新性在于首次揭示了miR-185-ARL8B-RAB5A信号轴在骨细胞网络形成中的核心作用，发现了ITGB1内吞循环在维持骨细胞形态中的新功能，并阐明了骨细胞通过调节细胞外基质组成影响骨矿化的新机制。这些发现不仅深化了对骨细胞生物学的理解，还为骨质疏松等骨骼疾病的治疗提供了新的分子靶点和理论依据。特别是miR-185作为潜在的治疗靶点，其拮抗剂可能成为雌激素缺乏性骨质疏松的新型治疗策略。