冷冻电镜揭示大型非编码RNA动态结构：为RNA结构生物学建立新范式

《BMC Methods》：Cryo-specimen preparation and imaging of highly-structured and dynamic large non-coding RNAs

本研究针对动态RNA结构解析的技术瓶颈，开发了一套完整的冷冻电镜分析流程。研究人员以自剪接II型内含子核酶为模型，通过优化样品制备、缓冲液条件和冷冻固定参数，成功解析了327-388个核苷酸的大型非编码RNA的高分辨率结构。该研究为柔性RNA分子的结构表征提供了重要方法论参考，对理解RNA调控的生物学机制和医学应用具有重要意义。

　　

在生命科学领域，RNA的三维结构研究长期以来一直落后于蛋白质结构研究。尽管RNA在基因表达调控、剪接、蛋白质合成和信号转导等关键生物学过程中发挥着重要的催化和调控功能，但截至目前，蛋白质数据库中仅保存了2,086个RNA结构，而蛋白质结构数量已达到230,019个（截至2025年4月17日）。这种巨大的差距严重限制了我们对RNA功能机制的理解，也阻碍了基于RNA结构的药物开发和疾病治疗研究。

造成这一现状的主要技术瓶颈在于RNA分子固有的柔性和动态特性。与相对稳定的蛋白质结构不同，许多功能性RNA需要在其三维结构中表现出一定的灵活性才能执行生物学功能。传统的结构生物学方法，如X射线晶体学、小角X射线散射（SAXS）和核磁共振（NMR），在解析这类动态RNA结构时面临着诸多限制。冷冻电镜（cryo-EM）技术的出现为这一领域带来了新的希望，它不需要结晶样品，对分子量没有严格限制，且能够在一定程度上捕捉大分子的动态特性。

然而，蛋白质游离RNA的冷冻电镜结构解析直到四年前才成为可能，目前仅有160个此类结构被解析，而蛋白质和蛋白质-核酸复合物的结构数量已达到25,892个。现有研究大多集中在结构稳定、刚性较强的RNA基序上，对于RNA构象异质性、灵活性和动态行为的理解仍然十分有限，目前主要依赖于二级结构探测研究或低分辨率三维结构研究。

针对这一技术空白，Jadhav和Marcia在《BMC Methods》上发表的研究工作，以自剪接II型内含子核酶为模型系统，建立了一套完整的实验流程，用于生产、纯化、生化/生物物理表征以及冷冻电镜成像和数据处理。研究人员特别关注了样品缓冲液组成和网格玻璃化条件的优化，这些因素对获得高质量的冷冻电镜数据至关重要。

关键技术方法

研究团队采用了一系列关键技术方法：通过体外转录和天然条件纯化获得高质量RNA样品；使用尺寸排阻色谱（SEC）评估样品均一性；结合多角度激光光散射（MALLS）精确测定分子量；利用质量光度法（MP）分析寡聚状态；通过小角X射线散射（SAXS）表征溶液中的构象行为；优化冷冻制样条件（包括样品浓度、吸滤时间和吸滤力）；在不同电压的冷冻电镜平台上采集数据；使用WARP和CryoSPARC软件进行数据处理和三维重构。

研究结果

RNA的生产与纯化

研究人员选择了Oceanobacillus iheyensis的II型内含子核酶的两个构建体作为研究对象：包含结构域1-5（D1-5）的高度结构化RNA和包含结构域1-3（D1-3）的动态折叠中间体。通过优化的体外转录和非变性纯化方案，成功获得了毫克级的高纯度、均质RNA样品。天然琼脂糖凝胶电泳显示样品迁移为单一条带，表明其构象均一性良好。

RNA均一性的生物物理表征

通过尺寸排阻色谱分析，D1-3和D1-5均显示单一洗脱峰，保留体积分别为17.17 mL和16.62 mL。SEC-MALLS进一步证实了构建体的均一性，其中D1-5表现出更好的单分散性。质量光度法测定显示D1-3和D1-5的分子量分别为109±14 kDa和133±20 kDa，与理论分子量（113 kDa和133 kDa）高度一致，且单体峰占比超过80%，满足结构研究的要求。

RNA靶点的溶液表征

SEC-SAXS分析显示，在高离子强度缓冲液（含10 mM Mg²⁺和150 mM K⁺）中，D1-3的实验Rg（回转半径）和Dmax（最大粒子尺寸）值与理论值更为接近。Crysol分析得出低盐和高盐条件下的X²值分别为1.79和1.14。有趣的是，在低盐缓冲液中计算出的ab initio珠模型显示从紧凑核心伸出的突起，表明该构建体具有灵活性。

冷冻电镜分析的玻璃化条件优化

研究发现RNA冷冻电镜制样需要比蛋白质样品更高的浓度（20-30μM，相当于2-4 mg/mL）。对于结构化的D1-5 RNA，使用适用于蛋白质样品的标准制样条件（吸滤力-7，吸滤时间1秒）即可获得良好结果。然而，对于柔性的D1-3 RNA，需要更精细的条件优化：最佳参数为吸滤力-10，吸滤时间1秒，这些条件能改善颗粒分布均一性并减少非特异性聚集。

网格玻璃化设置和图像质量与不同电子源显微镜的依赖性

研究比较了120 keV Tecnai T12、200 keV Glacios和300 keV Titan Krios显微镜的图像质量。结果显示，不同电压的电子源对颗粒外观影响不大，但动态RNA的某些特征（如柔性结构域的错误折叠）只有在数据采集和初步处理后才能被发现。对D1-3数据的2D分类和3D重构分析显示，在次优的冷冻条件下（吸滤力-9，吸滤时间2秒），颗粒显示出延伸的尾部特征，而在优化条件下这些特征消失。

亚优 plunge freezing 条件下的RNA结构错误折叠

比较不同冷冻条件下的D1-3颗粒显示，在吸滤力-9条件下制备的网格中，部分未折叠的D1-3颗粒较多，2D类别显示出从结构部分伸出的延伸尾部特征。3D体积重构表明D2和D3结构域形成连续的单螺旋，而在吸滤力-10条件下，这些结构域形成不同的茎环结构并停靠在D1上。

研究结论与讨论

本研究建立了一套系统的方法，用于获得良好折叠和柔性的大型非编码RNA的冷冻电镜数据并确定其结构。通过该方法，研究人员为这些具有挑战性的靶点提供了生化、生物物理和结构表征的流程，类似于先前为其他重要大分子复合物（如膜蛋白）建立的方法。

研究发现RNA制样需要比蛋白质更高的样品浓度（20-30μM），且结构化RNA可以使用适用于蛋白质样品的仪器设置进行玻璃化，而柔性RNA可能更难在玻璃冰中可视化，并且对冰厚度的优化更为敏感。克服非特异性展开和聚集的关键在于筛选不同的缓冲液，特别是一价和二价离子的浓度。

研究表明， plunge freezing 吸滤力和时间是优化冰厚度和图像对比度的最关键参数。这些参数的优化应以确保颗粒密度得以保留的方式进行。此外，网格玻璃化条件的优化并不强烈依赖于所用显微镜的电子源，但对于动态RNA，某些颗粒特征（如柔性结构域的错误折叠）可能只有在数据采集和初步处理后才能被发现。

这项研究为研究目前正在发现的非编码RNA的广阔类别提供了重要的方法论基础。随着对非编码RNA结构和功能的深入研究，越来越多的证据表明许多这类转录本采用功能重要的动态或部分柔性结构。因此，动态RNA成像的进展和严格的RNA表征协议（如本文提出的协议）对于研究当前正在发现的非编码RNA的广阔类别将具有高度相关性。

该工作流程的成功实施标志着RNA结构生物学向前迈出了重要一步，为理解RNA在健康和疾病中的功能机制提供了新的工具和见解，有望推动基于RNA的 therapeutic 策略的发展。