丹参素B通过铜介导的活性氧生成诱导氧化DNA损伤：潜在治疗剂的双刃剑效应

《Genes and Environment》：The Chinese herb component salvianolic acid B induces copper-mediated reactive oxygen species generation and oxidative DNA damage

本研究针对丹参素B(Sal B)这一具有潜在治疗价值的天然多酚，探讨其诱导活性氧(ROS)生成的新机制。研究人员通过细胞模型和体外实验证实，Sal B在铜离子(Cu(II))存在下可引发8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷(8-oxodG)形成，NADH能显著增强该过程。研究发现Sal B通过其儿茶酚基团与铜离子发生氧化还原反应，产生Cu(I)-过氧化氢复合物导致DNA链断裂和碱基特异性损伤。该研究为评估Sal B作为治疗剂时的促氧化风险提供了重要依据。

　　

在传统中药宝库中，丹参（Salvia miltiorrhiza）作为治疗心脑血管疾病的经典药材已有千年历史。其活性成分丹参素B(Salvianolic acid B, Sal B)因具有抗氧化、抗炎和抗纤维化等药理活性，近年来成为新药研发的热点。然而令人意外的是，这个被寄予厚望的天然化合物正在展现出"双刃剑"效应——越来越多的证据表明，Sal B在发挥治疗作用的同时，可能通过诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生而对细胞造成潜在威胁。

尽管先前研究已观察到Sal B能够提升细胞内ROS水平，但其分子机制始终迷雾重重。金属离子在氧化应激中扮演着重要角色，其中铜离子因其与DNA的特殊亲和力而备受关注。铜离子不仅能紧密结合DNA，还可与化学物质相互作用导致核酸氧化损伤。这种金属介导的DNA损伤机制是否也适用于Sal B，成为研究人员亟待解答的科学问题。

在这项发表于《Genes and Environment》的研究中，Kobayashi等科学家团队开展了一系列精巧的实验，逐步揭开了Sal B诱导DNA损伤的神秘面纱。研究团队首先在人类白血病HL-60细胞模型中发现，Sal B处理显著增加了8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷(8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, 8-oxodG)的形成——这是DNA氧化损伤的关键生物标志物。更为重要的是，当使用巴索铜灵(bathocuproine)这种铜(I)特异性螯合剂进行预处理时，DNA损伤明显受到抑制。此外，在过氧化氢耐受的HP100细胞（HL-60的衍生株）中，Sal B未能诱导显著的8-oxodG形成。这些发现强烈提示，铜(I)和过氧化氢(H₂O₂)在Sal B引起的细胞内氧化DNA损伤过程中起着核心作用。

为了深入探索这一现象背后的化学机制，研究人员在牛胸腺DNA体系中进行了更为可控的体外实验。结果显示，Sal B与铜(II)共同作用时，能够引起浓度依赖性的8-oxodG形成。而令人惊讶的是，当加入生理浓度的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型）后，DNA损伤程度急剧增加了20-30倍。NADH作为内源性还原剂，可能通过建立氧化还原循环而放大金属介导的DNA损伤效应。

研究采用的关键技术方法包括：使用高效液相色谱-电化学检测(HPLC-ECD)系统定量分析8-oxodG；通过³²P-5'-末端标记DNA片段技术检测DNA损伤位点；应用Maxam-Gilbert测序法确定DNA切割的特异性位点；利用密度泛函理论(density functional theory, DFT)计算分析分子轨道特性；并采用多种活性氧清除剂进行机制验证。

Sal B在铜(II)和NADH存在下对³²P标记DNA片段的损伤

通过³²P-末端标记的人c-Ha-ras-1原癌基因和p16肿瘤抑制基因DNA片段，研究人员详细分析了Sal B引起的DNA损伤特征。在铜(II)和NADH存在下，Sal B以剂量依赖方式导致DNA链断裂，且经哌啶处理后损伤进一步增强，表明不仅发生了DNA骨架断裂，还存在碱基修饰。

铜(II)和NADH存在下Sal B诱导DNA损伤的位点特异性

DNA测序分析揭示了Sal B引起的损伤具有明显的位点偏好性——主要发生在胸腺嘧啶残基，特别是鸟嘌呤相邻位置，以及部分胞嘧啶位点。这种碱基特异性损伤模式暗示，除自由羟基自由基(·OH)外，可能还有其他活性氧物种参与其中，因为·OH通常会引起非特异性DNA切割。

活性氧清除剂和铜(I)螯合剂对Sal B诱导DNA损伤的影响

机制探索实验表明，典型的·OH清除剂（如乙醇、甘露醇和甲酸钠）未能有效防止DNA损伤，而广谱活性氧清除剂甲硫醛(methional)、过氧化氢酶(catalase)和铜(I)螯合剂巴索铜灵则显著抑制了损伤过程。这些结果支持了铜(I)-过氧化氢复合物作为关键活性物种的假说，该复合物可能以"结合型羟基自由基"的形式发挥作用，在自由扩散前就攻击邻近的DNA碱基。

Sal B的最高占据分子轨道(HOMO)定位

理论计算显示，Sal B分子中的三个儿茶酚单元并非等效参与氧化还原反应。密度泛函理论计算表明，最高占据分子轨道(highest occupied molecular orbital, HOMO)主要定位于其中一个儿茶酚基团（儿茶酚B），其HOMO能量为-7.67 eV。分子内氢键稳定了该区域的羟基供体，增强了电子密度，从而提高了还原能力。相比之下，结构相似的迷迭香酸(rosmarinic acid)因缺乏此类分子内氢键，其HOMO能量较低(-7.81 eV)，还原能力相对较弱。

基于上述实验结果，研究人员提出了Sal B诱导氧化DNA损伤的分子机制模型：Sal B分子中电子富集的儿茶酚基团发生自氧化，生成相应的邻半醌自由基和邻醌，同时将铜(II)还原为铜(I)。铜(I)促进分子氧转化为超氧阴离子(O₂·^-)，并进一步歧化为过氧化氢。铜(I)与过氧化氢形成高反应性的铜(I)-过氧化氢复合物，直接攻击DNA导致氧化损伤。NADH则通过将氧化的Sal B还原为原始形态，建立氧化还原循环，持续促进活性氧生成和DNA损伤。

这项研究系统揭示了Sal B通过铜介导的机制诱导氧化DNA损伤的新途径，强调了这种天然多酚在特定条件下的促氧化风险。特别是在生理相关浓度的铜(II)（20μM）和NADH（100μM）存在下，Sal B仍能引起显著DNA损伤，这为其体内应用的安全性评估提供了重要参考。研究结果提醒我们，在开发Sal B作为治疗剂时，必须谨慎评估其双刃剑效应，平衡其治疗益处与潜在基因毒性风险。这一发现不仅对中药现代化研究具有启示意义，也为天然产物安全性评价建立了新的方法论范式。