针叶树种和地理位点共同塑造针叶树针叶微生物组的多样性与功能潜力

《Microbiome》：Host species and geographic location shape microbial diversity and functional potential in the conifer needle microbiome

本研究针对森林生态系统针叶微生物组功能认知不足的现状，首次应用鸟枪法宏基因组学对落基山脉6个位点、3种亚高山针叶树（脂松、花旗松和恩氏云杉）的针叶表面微生物群落进行了深入解析。研究成功重建了447个宏基因组组装基因组（MAG），揭示了微生物群落组成和代谢功能在不同树种和地理位点间存在显著差异，且位点的影响强于树种。研究发现微生物具有降解α-蒎烯（α-pinene）等挥发性有机物（VOC）和多种多糖的潜力，并通过移动遗传元件（MGE）和水平基因转移（HGT）实现适应性进化。该数据集为理解针叶微生物组在时空尺度上的生态功能奠定了重要基础。

　　

在广袤的温带和北方生态系统中，针叶林占据着主导地位，发挥着碳汇、调节水循环、控制土壤侵蚀以及为众多动植物提供栖息地等关键的生态系统服务功能。然而，气候变化正日益威胁着这些森林。当前，森林管理往往忽视了树木微生物组的重要性，这其中就包括生活在植物地上部分，即叶际（Phyllosphere）的微生物群落。叶际是地球上最大的微生物栖息地之一，其微生物在养分循环、植物生长以及缓解生物和非生物胁迫方面扮演着重要角色。尽管农作物和模式植物的叶际已被广泛研究，但森林树木，尤其是针叶树的叶际微生物组仍是一个相对未被充分探索的领域。

与短暂存在的农作物叶片不同，针叶树的针叶可以存续数年甚至数十年，为微生物定殖提供了长期稳定的表面。针叶树本身寿命极长，能够维持这些微生物群落跨越很长的时间尺度。针叶树针叶富含单萜（如α-蒎烯）和酚类化合物等次生代谢物，创造了独特的化学环境，可能筛选出能够耐受甚至代谢这些化合物的特定微生物类群。此外，多糖分解是叶际微生物的另一项关键功能，对森林碳循环具有更广泛的影响。尽管基于16S rRNA基因扩增子的研究已初步揭示了针叶树针叶细菌群落的多样性，并表明局部位点因素比树种身份或生长季节时间对群落的影响更大，但针叶树针叶微生物组的功能潜力，特别是在多糖分解、移动遗传元件（MGE）在适应中的作用以及甲烷循环潜力等方面，仍然知之甚少。更重要的是，此前尚未有研究对针叶树针叶微生物组应用鸟枪法宏基因组学技术。

为了填补这一空白，发表在《Microbiome》上的这项研究，对来自美国落基山脉六个位点（从蒙大拿州的冰川国家公园到科罗拉多州的落基山生物实验室，跨度约1075公里）的三种亚高山针叶树（脂松、花旗松和恩氏云杉）的针叶表面微生物组进行了宏基因组测序。研究人员收集了67棵树的针叶样本，对每个样本进行了单独的宏基因组测序和组装，同时还为每种针叶树宿主生成了大规模共组装。从这些数据集中，他们重建了447个宏基因组组装基因组（MAG），其中417个在物种水平上是非冗余的。除了增加提取的MAG总数外，共组装还获得了三个非常大的MAG，代表了宿主基因组的部分序列。对所有微生物MAG的系统基因组学分析显示，群落主要由细菌（n=327）和真菌（n=117）组成。

为开展研究，作者运用了几个关键技术方法：首先，从落基山脉六个地理位点的三种针叶树（脂松、花旗松、恩氏云杉）的67棵个体树木上采集针叶样本，并通过超声清洗和离心富集针叶表面微生物后进行DNA提取。其次，使用Illumina HiSeq 2500平台进行鸟枪法宏基因组测序，并对每个样本进行个体组装（metaSPAdes），同时为每种宿主树种创建共组装（MetaHipMer2）。第三，利用MetaBAT2进行宏基因组分箱获得MAG，并通过CheckM2（细菌）和EukCC（真菌）评估基因组质量。第四，基于单拷贝标记基因（细菌56个，真菌BUSCO标记）构建系统发育树对MAG进行分类学鉴定。第五，通过读取映射计算MAG相对丰度，并利用DESeq2进行差异丰度分析，使用vegan包进行PERMANOVA分析群落差异。第六，使用dbCAN3注释碳水化合物活性酶（CAZyme），通过geNomad和VirSorter2鉴定移动遗传元件（MGE），并利用MetaCHIP检测水平基因转移（HGT）事件。

宿主树种和地理位点塑造了针叶相关微生物组的多样性

微生物群落组成分析表明，细菌群落主要由 Alphaproteobacteria、Bacteroidota 和 Gammaproteobacteria 成员主导，特别是 Acetobacteraceae、Sphingomonadaceae 和 Burkholderiaceae 等科。真菌群落则以子囊菌门（Ascomycota）为主。非度量多维标度（NMDS）和置换多元方差分析（PERMANOVA）显示，无论是细菌还是真菌群落，其组成均受到宿主树种和采样位点的显著影响，但位点解释的变异（细菌 R² = 0.26，真菌 R² = 0.28）要大于宿主树种（细菌 R² = 0.11，真菌 R² = 0.05），表明地理位点相关环境因素（如气候、周围栖息地微生物源）的影响更强。差异丰度分析进一步揭示了特定微生物类群在不同树种和位点中的富集或耗竭模式，例如，Hymenobacteraceae（Bacteroidota）在恩氏云杉中显著富集，而 Moraxellaceae（Gammaproteobacteria）在花旗松中更为丰富。

挥发性有机化合物代谢：对针叶树化学环境的适应

针叶树会释放多种挥发性有机化合物（VOC），其中α-蒎烯（α-pinene）是一种含量丰富的单萜烯。功能注释分析发现，编码α-蒎烯降解的基因在针叶微生物组中最为普遍，主要存在于 Acetobacteraceae、Sphingomonadaceae 和 Burkholderiaceae 等细菌家族中。这表明这些细菌可能通过利用这些化合物作为碳源并减轻其抗菌特性，从而在针叶表面茁壮成长。相比之下，针对甲醇、香叶醇和苯酚等其他VOC的降解基因相对稀少。研究还检测到甲烷氧化和固氮基因，主要存在于 Beijerinckiaceae 科的 Methylocystis 属中，提示这些甲烷氧化型固氮微生物可能在针叶叶际的碳氮耦合循环中发挥作用。

碳水化合物活性酶分布：专业化的多糖代谢

对碳水化合物活性酶（CAZyme）的分析揭示了针叶微生物组在多糖代谢方面的强大功能潜力。 Bacteroidetes 门（尤其是 Hymenobacteraceae、Sphingobacteriaceae 和 Spirosomaceae 科）的MAGs consistently 显示出最高的CAZyme基因数量。此外，属于 Armatimonadota 门的 Chthonomonas calidirosea 的两个MAGs也含有异常高的CAZyme基因计数。这些CAZyme能够靶向多种碳水化合物底物，包括纤维素、木聚糖、几丁质、果胶和阿拉伯半乳聚糖。这种降解多种多糖的能力可能增强了细菌在营养受限的针叶表面的生态灵活性，并在碳循环中起到关键作用。

针叶叶际中的移动遗传元件和水平基因转移

对移动遗传元件（MGE）的分析鉴定出大量MGE序列，包括51个完整的噬菌体基因组和140个高质量的MGE。MGEs（包括噬菌体和质粒）广泛存在于几乎所有的细菌家族中。然而，MGE的分布表现出明显的谱系特异性，即MGE的转移主要发生在亲缘关系较近的类群内部，跨家族的MGE转移事件很少。对结合质粒的分析揭示了 traN 基因等结合转移机制相关基因的保守性。另一方面，水平基因转移（HGT）事件则显示出更广泛的分类学范围，在 Acetobacteraceae 和 Sphingomonadaceae 等类群中尤为活跃。 horizontally transferred genes 的功能分类显示，其中大量基因与噬菌体和转座子功能相关，但也包括CAZyme等代谢基因，表明HGT在传播关键功能性状方面发挥了作用。

研究结论与意义

本研究通过宏基因组学方法首次全面揭示了针叶树针叶表面微生物组的分类和功能多样性。研究结果表明，宿主树种和地理位点共同塑造了针叶叶际的微生物群落，其中位点的影响略占主导。微生物群落，特别是优势细菌类群，展现出对针叶树特有化学环境（如VOC降解）和资源利用（如复杂多糖代谢）的高度适应性。MGEs主要介导谱系内的基因流动，而HGT则促进了更广泛的基因交换，这两种机制共同增强了微生物群体在严酷且多变的叶际环境中的适应性和韧性。

这项研究建立的针叶叶际微生物MAGs数据集和功能图谱，为未来深入探索针叶微生物组在时空尺度上的动态、其对宿主健康的影响以及在全球森林生态系统生物地球化学循环（如碳、氮循环）中的作用提供了宝贵的资源。研究结果强调，针叶树作为重要的微生物储库，其叶际微生物的多样性和功能潜力与宿主特性及环境背景紧密交织，对于理解森林健康、恢复力以及生态系统功能具有重要意义。