新一代应激诱导型Komagataella phaffii启动子变体的构建与表征及其在重组蛋白生产中的应用

《Microbial Cell Factories》：Next-generation stress-inducible Komagataella phaffii promoter variants

本研究针对Komagataella phaffii（巴斯德毕赤酵母）启动子工具箱在强度和调控灵活性方面的不足，特别是对甲醇诱导型启动子（如PAOX1）和生长耦合型启动子（如PGAP）的依赖问题，通过半理性系统扫描PDH（HSP12基因上游352 bp区域）启动子，构建了152个变体，并利用细胞内eGFP和分泌型AbrUPO、CalB等报告蛋白进行评价。研究发现了活性高达亲本启动子250%的多组合变体（如allA、MV1、MV2），并在摇瓶和分批补料培养中验证了其在高价值酶生产中的优势，MV2变体使CalB产量提高了80%。该研究不仅拓展了K. phaffii无甲醇、非生长耦合表达工具箱，为多基因平衡表达和合成生物学应用提供了新工具，还深化了对PDH启动子序列功能关系的理解。

　　

在生物技术领域，Komagataella phaffii（原名巴斯德毕赤酵母）作为一种重要的微生物细胞工厂，以其高效分泌蛋白质和实现典型真核生物翻译后修饰（如N-糖基化和二硫键形成）的能力而闻名。然而，其重组蛋白生产（Recombinant Protein Production, RPP）过程仍面临挑战。长期以来，研究人员严重依赖少数几个核心启动子，尤其是甲醇利用（Methanol Utilization, MUT）途径衍生的启动子（如强效但需甲醇诱导的P_AOX1）和中心代谢相关的组成型启动子（如生长耦合的P_GAP）。甲醇的易燃易爆特性带来了安全和成本问题，而生长耦合型启动子将蛋白生产与生物量积累捆绑，限制了过程持续时间，并对细胞毒性蛋白的表达不友好。因此，开发无需危险诱导剂、且与细胞生长解耦的新型高效启动子，对于提高生物过程效率、扩大K. phaffii的应用范围至关重要。

近年来，通过从头发现或对现有启动子进行工程化改造，K. phaffii的启动子工具箱得到了一定扩展。其中，源于热休克蛋白12（Heat Shock Protein 12, HSP12）基因上游区域的P_DH启动子表现出独特的优势：它不依赖甲醇，具有强表达特性，并且其表达调控与细胞生长解耦，在碳源严重限制条件下能被有效激活，为重组蛋白的延长生产窗口提供了可能。尽管P_DH前景广阔，但其序列与功能之间的关系尚不明确，其强度仍有提升空间。为此，Ebner等人开展了一项系统性的启动子工程研究，旨在深入解析P_DH的调控机制，并创建性能更优的新一代变体，相关成果发表在《Microbial Cell Factories》上。

为开展研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先，他们采用了半理性的系统块扫描（Block-Scanning）方法，使用两种不同长度的序列模块（10 bp的V序列“GATAACCGTG”和3 bp的A序列“AAA”）系统性地替换P_DH启动子的每一个相应区段，生成了152个单点变体（V文库35个，A文库117个）。其次，利用细胞内增强型绿色荧光蛋白（eGFP）作为报告基因，在96孔板高通量微尺度培养体系中对这些变体的活性进行了初步表征和筛选。随后，将筛选出的有益突变进行组合，构建了多组合变体，并进一步使用分泌型报告蛋白（来自Hypoxylon sp. EC38的非特异性过氧合酶AbrUPO和来自Candida antarctica的工业用脂酶B, CalB）在摇瓶规模验证变体的性能。最后，对最优变体（MV2-C）在5 L生物反应器中进行了碳限制的分批补料培养（Fed-batch cultivation），以评估其在更接近工业生产条件下的表现。研究中使用了KU70缺陷型的K. phaffii菌株（BSY10dKU70）以促进表达盒在基因组AOX1位点的靶向单拷贝整合，确保了启动子活性比较的可靠性。蛋白分析方面，分别采用了荧光检测（eGFP）、ABTS氧化法（AbrUPO）和对硝基苯基丁酸酯（pNPB）水解法（CalB）来定量蛋白产量。

结果

P_DH的系统扫描产生了活性高达亲本150%的新型启动子变体

研究人员通过系统性地用V序列块和A序列块替换P_DH的每一个区段，构建了包含152个变体的文库。利用细胞内eGFP作为报告基因，在高通量微尺度培养中评估了这些变体的活性。结果显示，两种文库的变体均表现出与亲本P_DH不同的强度和调控模式，活性范围约为亲本启动子的10%至150%。其中，V文库的变体V17和V18表现出最高的活性。许多变体在两个采样时间点（碳源耗尽时和补料后）显示出与亲本相似的关系，表明调控模式未发生根本改变，但少数变体（如V1, V3, V11, V12, A13）在两个时间点的活性关系差异显著，提示其调控可能出现了异常。研究还观察到明显的序列块特异性效应，即在同一区域进行不同序列块（V块与A块）替换的变体，其表达结果差异巨大，这表明观察到的表达效应并非仅仅源于对潜在激活剂或阻遏蛋白结合位点的干扰，插入的V序列块本身可能产生了积极的效应。

DH启动子。使用两种不同的序列块，V(5'GATAACCGTG 3')和A(5'AAA 3')，通过小的序列替换对P_DH进行扫描。所有变体的初步评估均在高通量96孔板微尺度分析中使用细胞内eGFP作为报告基因进行。相对启动子活性显示为经OD₆₀₀校正后的荧光值，并归一化至亲本P_DH在碳源完全耗尽时（48小时）和经过48小时低碳源脉冲补料培养后的荧光输出。所示数值代表代表性菌株三次生物学重复培养的平均值，并显示标准偏差。B 推定的调控位点示意图。图中标示了推定的TATA框、TATA框样序列、通过手动序列比对预测的转录因子结合位点（TFBS）以及转录起始位点（TSS）。通过PROMO（斜体、下划线）、JASPAR（粗体）和YEASTRACT（斜体）预测的推定TFBS和顺式作用元件已被标注。'>

P_DH的调控热点及其对转录控制的意义

通过对变体活性数据的分析和生物信息学工具（PROMO, JASPAR, YEASTRACT）对P_DH序列的预测，研究揭示了P_DH中可能存在的重要调控区域和转录因子结合位点。启动子前100 bp（-352 到 -252，对应变体V1-V10, A1-A35）的区域大多序列替换未引起启动子活性的剧烈变化，表明该区域可能不包含参与基础活性调控的主要顺式作用元件。随后的约90 bp区域（-252 到 -162，对应变体V11-V19, A37-A64）的序列替换对启动子强度产生了强烈但不一致的影响（或增强或减弱），表明该区域是一个潜在的调控热点。在此区域及下游，生物信息学分析预测了多个可能的转录因子结合位点，包括与一般应激反应相关的Msn2p结合位点（应激响应元件STRE）、碳源响应因子Mxr1p（KpAdr1）的结合位点、呼吸基因调控因子Hap4p的结合位点、热休克转录因子Hsf1的结合位点（热休克元件HSE核心 motif ‘GAA’的重复序列）以及可能参与负调控的Aft1/2p结合位点。启动子最后160 bp区域（-162 到 -1，对应变体V20-V35, A65-A117）的修饰，特别是V20-V25（-162 到 -102）区域，对启动子活性 consistently 显示出负面影响，某些变体活性仅为亲本的10%，凸显了该区域对转录的重要性。在该区域未发现典型的TATA框，但预测了三个ScAbflp结合位点。在V26-V28区域发现了两个可能启动前起始复合物（Preinitiation Complex, PIC）组装的位点，其中一个符合酵母TATA框共有序列‘TATAWAWR’，另一个显示为TATA样基序。这些发现与典型的酵母启动子结构（TATA框位于翻译起始位点上游80-100 bp）相符。

有益突变的组合导致第二代P_DH变体表达量提高两倍

在获得第一代变体并识别出潜在的有益突变和可修饰区域后，研究人员采取了两种策略来创建第二代P_DH变体：一是将V文库和A文库中有趣的和/或活性增强的变体进行组合，构建多组合变体（如allA, MV1, MV2, PDH_V17/18），以评估潜在的叠加效应；二是在启动子的最上游区域（1-50 bp或50-100 bp）通过替换野生型序列的方式，引入已知的顺式作用元件（HSE ‘GAA’、STRE ‘CCCCT’ 和 Phd1结合位点 motif ‘TGCA’），以四聚体形式交替置于两条DNA链上。初步评估仍使用细胞内eGFP在微尺度下进行。结果表明，只有多组合变体显示出增强的启动子活性，而添加额外顺式作用元件的变体其活性与亲本启动子相当或更低。多组合变体allA, MV1和MV2表现出最高的总体活性，在不同时间点达到亲本P_DH的200%-225%，是组成型基准P_GAP的2到6倍。有趣的是，包含两个最佳单点替换（V17和V18）的变体PDH_V17/18的活性（亲本的110-130%）低于单个变体，而包含A文库替换（A79和A117）的组合变体则显示出明显的协同效应。

DH变体，示意图（A）及使用细胞内eGFP作为报告基因在高通量微尺度中初步测定启动子活性（B）。A 创建了11个第二代变体，包括5个多组合变体（有趣V和A变体的组合）和6个带有额外顺式作用元件（替换野生型序列）的变体。顺式作用元件HSE（‘GAA’）、STRE（‘CCCCT’）和Phd1结合位点基序（‘TGCA’）以四个连续重复的形式，交替置于两条DNA链上，定位在P_DH最上游部分的两个不同位置（UP=1-50 bp 或 DW=50-100 bp）。B 初步评估再次使用细胞内eGFP在高通量96孔板分析中进行。相对启动子活性显示为经OD₆₀₀校正后的荧光值，并归一化至亲本P_DH。在培养的五个不同时间点（从21小时开始，至168小时结束）进行测定。所示数值代表代表性菌株三次生物学重复培养的平均值，并显示标准偏差。'>

当使用分泌型报告蛋白AbrUPO进行初步筛选时，观察到了与eGFP相似的趋势，但总体改善程度较低。在摇瓶规模下，对三个最有前景的变体（allA-U, MV1-U, MV2-U）进行了评估。在严格的碳限制条件下，allA-U和MV1-U相比亲本P_DH的AbrUPO产量分别提高了约40-60%和60-80%，是P_GAP基准的4到7倍。

利用P_DH变体生产重组CalB的效果是经典无甲醇系统的两倍

研究人员进一步利用筛选出的最优P_DH变体（包括单变体V17, A60, A79, A117以及多组合变体allA, MV1, MV2）来生产工业上重要的Candida antarctica脂肪酶B (CalB)。在摇瓶培养中，大多数变体在解抑阶段（培养44小时）的脂肪酶活性均超过了亲本P_DH-C，范围在2到5倍之间。特别是多组合变体MV1-C和MV2-C，在批次阶段就表现出较高的产量。培养结束时，MV1-C和MV2-C的脂肪酶活性分别比亲本P_DH-C提高了60%和90%，相当于总蛋白产量达到97±10和111±2 mg L^-1。与微尺度培养相比，摇瓶中观察到的更高提升可能归因于应用了更严格的碳限制条件。

DH变体评估CalB产量，以酶活性表示。A 相对启动子活性显示为上清液中平均酶活性归一化至P_DH-C的值。B 上清液中的脂肪分解活性以体积活性表示。在伪饥饿条件下评估了四个单变体和三个多变体的性能，并与基准UPP-C、GAP-C和P_DH-C进行了比较，其中前两者是生长耦合系统，后者是生长解耦系统。在24小时的批次阶段后，向每个摇瓶中添加一个甘油FeedBead?以达到伪饥饿条件。误差棒代表三次生物学重复培养的标准偏差。'>

新型多组合变体MV2-C在分批补料培养中表现出可靠的高性能

为了在更接近工业生产的条件下验证变体性能，研究人员选择了CalB生产表现最佳的变体MV2-C，在5 L生物反应器中进行碳限制的分批补料培养，控制比生长速率（μ）在0.025 h^-1，目标最终生物量为80 g L^-1 DCW。结果表明，MV2-C在整个补料期间持续产生CalB，其最终蛋白滴度比亲本P_DH-C高出80%，比在最佳条件下（高μ=0.15 h^-1）测试的P_GAP-C高出约3倍。MV2-C在低μ下的比生产速率（q_p）比P_DH-C和P_GAP-C分别提高了1.7倍和3.1倍。尽管P_GAP在优化条件下（高μ，过程时间短）实现了更高的体积产率（Q_v），但MV2-C的产品对生物量得率（Y_p/x）比P_DH-C和P_GAP-C分别高出60%和500%。重要的是，基于P_DH-MV2的非生长耦合系统允许在较慢的比生长速率下进行更长的过程时间，同时保持高生产水平，从而获得更高的最终蛋白滴度、得率和碳效率，相比甲醇诱导的P_AOX1过程也具有操作和安全优势。

DH变体。A 相对启动子活性，表示为平均酶活性归一化至P_DH-U的值。B 上清液中的酶活性，以体积活性表示。比较了三个多组合变体（AllA-U, MVI-U 和 MV2-U）与基准GAP-U和P_DH-U的酶活性。摇瓶培养在三次重复下进行，采用严格的碳限制条件（伪饥饿），即在24小时批次阶段后通过添加单个甘油FeedBead?来实现。误差棒代表三次生物学重复培养的标准偏差。'>

结论与讨论

本研究成功通过半理性系统扫描和组合优化，对K. phaffii的P_DH启动子进行了有效的工程化改造。研究不仅生成了一系列具有不同强度和调控特性的新型启动子变体，还深化了对P_DH序列功能关系的理解，识别了可能的调控热点和顺式作用元件。引入的10 bp V序列块被证明是一种有效的启动子强化工具。所创建的第二代多组合变体（如MV2）在摇瓶和分批补料培养中均表现出色，能显著提高细胞内报告蛋白（eGFP）和分泌型工业用酶（CalB, AbrUPO）的产量，其性能优于亲本P_DH，并在某些方面可与经典的甲醇诱导型P_AOX1启动子相媲美。这些新型非生长耦合、甲醇非依赖型启动子变体极大地丰富了K. phaffii的调控元件工具箱，为单基因表达优化、多基因平衡表达（如多酶途径）以及合成生物学中的应用提供了宝贵资源。虽然其全部潜力仍有待通过针对特定应用的启动子特异性工艺优化来验证，但本研究已为开发更高效、更安全、更可持续的K. phaffii重组蛋白生产工艺奠定了坚实基础，展示了启动子工程在优化微生物细胞工厂方面的强大能力。

-1）下的生物量浓度（DCW）和CalB产量（滴度）随甘油补料时间的变化曲线，并与近期发表的高μ（0.15 h^-1）下的GAP-C以及低μ（0.025 h^-1）下的GAP-C和P_DH-C的结果进行了比较。误差棒代表分析测量的标准偏差。'>