代谢工程改造探索链霉菌：利用海藻水解物高效合成反向抗生素尼博霉素

《Microbial Cell Factories》：Metabolic engineering of Streptomyces explomaris for increased production of the reverse antibiotic nybomycin

本研究针对反向抗生素尼博霉素产量低的瓶颈，通过异源表达和系统代谢工程策略，在海洋链霉菌宿主中实现产量突破。研究人员筛选获得高性能宿主Streptomyces exploraris，通过转录组分析锁定调控因子与前体供应限制关键靶点，结合删除抑制蛋白（ΔnybWX）及过表达前体通路基因（zwf2、nybF），使尼博霉素产量提升至57 mg·L?1，较基准提高5倍。该研究首次验证海藻水解物作为可持续发酵底物的可行性，为抗耐药菌药物开发提供新思路。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的背景下，革兰氏阳性耐药菌（如耐氟喹诺酮类金黄色葡萄球菌）的蔓延对公共卫生构成严重威胁。尼博霉素（nybomycin）作为一种结构独特的“反向抗生素”（reverse antibiotic），能够特异性抑制携带gyrA S84L突变的耐药菌株，逆转其耐药表型，因而成为极具潜力的候选药物。然而，天然产生菌的尼博霉素产量普遍低于2 mg·L^?1，严重限制其临床开发。传统代谢工程策略在模式链霉菌中仅将产量提升至12 mg·L^?1，表明宿主选择与调控机制解析是突破产量瓶颈的关键。

为此，Wei Shu等人发表于《Microbial Cell Factories》的研究，首次系统评估了多种海洋与陆地链霉菌作为尼博霉素异源表达宿主的潜力。通过比较分析，团队发现海洋分离株Streptomyces exploraris Je 1-4表现出最优的产量基础。进一步通过时间分辨转录组分析，揭示尼博霉素生物合成基因簇（nyb BGC）存在关键转录抑制因子（nybW、nybX）及前体供应不足（如NADPH、E4P）的双重限制。基于此，研究团队通过组合基因编辑策略，成功构建高产工程菌株NYB-3B，并在海藻水解物中验证其可持续发酵能力，为尼博霉素的规模化生产与临床应用奠定基础。

本研究主要采用以下关键技术：① 基于16S rRNA基因的系统发育分析筛选异源宿主；② 时间分辨RNA测序（RNA-seq）解析转录瓶颈；③ 细菌人工染色体（BAC）介导的基因簇异源表达与Red/ET重组系统进行基因编辑；④ 模块化代谢工程策略（如过表达zwf2、tkt、nybF）；⑤ 海藻（Himanthalia elongata）酶解制备可再生培养基；⑥ 液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）定量尼博霉素。

筛选获得高性能宿主S. exploraris

研究团队首先对比了7种链霉菌（包括3株海洋来源与4株陆地来源）的尼博霉素生产能力。如图2所示，携带nyb基因簇的S. exploraris 4N24在甘露醇培养基中产量达11.0 mg·L^?1，显著优于其他菌株（如S. albidoflavus 4N24仅0.8 mg·L^?1）。该菌还能高效利用混合糖源（葡萄糖、甘露醇、半乳糖等），且尼博霉素合成与生长阶段解耦，呈现独特的两阶段生产模式。

转录组解析瓶颈机制

通过发酵过程4个时间点（17 h、36 h、75 h、175 h）的转录组分析（图3），研究发现41.2%~50.6%的基因组基因表达发生显著变化。关键发现包括：① 戊糖磷酸途径（PP pathway）基因（如zwf2、tkt）在静止期下调，限制E4P和NADPH供应；② Shikimate途径关键酶基因（如DAHP合酶基因005807）表达降低；③ nyb基因簇中抑制因子nybW（TetR家族）和nybX（同源于S. coelicolor ScbR2）持续高表达，而潜在激活因子nybY/Z下调。这些结果提示转录抑制与前体供应不足是主要限速环节。

调控工程解除转录抑制

通过删除nybWX（构建NYB-1）或全部调控基因nybWXYZ（构建NYB-2），验证了nybWX的核心抑制作用。如图4B所示，NYB-1产量达39.2 mg·L^?1（提高3.4倍），而NYB-2产量（23.2 mg·L^?1）低于NYB-1，表明nybY/Z可能具有激活功能。

代谢工程强化前体供应

在NYB-1基础上，研究团队构建了包含zwf2（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、tkt（转酮酶）、nybF（DAHP合酶）的模块化组合菌株（图4A）。其中，NYB-3B（过表达zwf2+nybF）产量最高（57.6 mg·L^?1，图5D），且生长速率与生物量显著提升；而三联过表达菌株NYB-4因代谢失衡导致产量下降（图5F），说明基因组合需平衡代谢流。

海藻水解物验证可持续生产

使用商品褐藻（Himanthalia elongata）酶解液（含葡萄糖与甘露醇）作为唯一碳源时，NYB-3B产量达14.8 mg·L^?1（图6B），虽低于合成培养基，但证明了海藻资源作为低成本底物的可行性。

结论与展望

本研究通过多组学指导的代谢与调控工程，成功将S. exploraris改造为尼博霉素高产底盘菌，产量创当前最高纪录（57 mg·L^?1）。研究首次揭示nybWX的转录抑制机制及前体供应模块（如zwf2）的关键作用，并开创性利用海藻水解物实现绿色生物制造。该工作为反向抗生素的临床开发提供供应保障，同时为海洋微生物资源在合成生物学中的应用树立范例。未来需进一步优化发酵工艺（如原位产物移除）以提升产业化潜力。