在受控的、小规模的PVC饮用水系统实验室中，研究早期生物膜的生长和运动行为

《Environmental Science: Water Research & Technology》：Examining the growth and mobilization behavior of early-stage biofilms in a controlled, pilot scale PVC drinking water system laboratory

生物膜在受控PVC饮用水系统中的早期生长行为及冲刷迁移特性研究，通过分子与荧光显微分析，发现生物膜在管道底部（invert）快速积累并形成团簇结构，而在顶部（springline和obvert）较少。高流速冲刷（6.5 L/s）未能完全清除生物膜，证实其物理结构稳定性和抗冲刷能力。研究为饮用水系统生物膜控制提供实验依据。

　　本研究探讨了在受控的PVC管道模型中，早期生物膜的生长和迁移行为。研究采用了一种替代方法，通过从自来水系统中获取微生物浓集液进行接种，从而在28天内形成生物膜。此外，通过营养物质的添加和消毒剂的耗尽，进一步促进了生物膜的形成。实验结束后，通过冲洗管道以观察生物膜的迁移情况。通过分子分析和荧光显微镜技术，对管道中的生物膜和可去除的管道壁样本进行了评估。研究结果显示，生物膜在管道壁上经历了两个快速生长阶段，分别在0至14天以及21至28天之间；在14至21天期间，生物膜的生长似乎停滞，这可能与微生物群落结构的变化有关。此外，生物膜主要在管道的倒角（invert）位置聚集，而在弹簧线（springline）和顶面（obvert）位置则迅速减少。实验发现，6.5升每秒的冲洗流量不足以完全清除管道壁上的生物膜，并且即使在冲洗后，生物膜仍以簇状形式存在于管道壁上，保持其附着状态。尽管实验方法可能影响了生物膜的特性，但它们在物理结构上仍与实际运营的饮用水管网中的生物膜相似。研究结果有助于进一步了解生物膜在饮用水系统中的生长和迁移行为，并为未来的研究提供了可重复的实验方法。

生物膜在饮用水系统中普遍存在，常与水质问题密切相关。本研究揭示了在PVC管道主干中早期生物膜的重要特征，以及水力作用对其在管道壁上的积累和迁移的影响。这些发现丰富了关于饮用水系统中生物膜的现有知识，并支持水务公司对生物膜在实际管网中的管理。生物膜的形成通常与微生物在管道内壁的附着有关，这些微生物会分泌胞外聚合物物质（EPS），包括蛋白质、腐殖酸、多糖和核酸等，以构建生物膜的结构并赋予其功能。EPS还帮助生物膜抵抗剪切力，并保护微生物免受消毒剂的伤害。

生物膜的生长和演化过程包括多个阶段。通常，生物膜由适应于附着在固体表面的微生物菌落开始，随后这些微生物生长形成宏观结构，覆盖管道的内壁。某些细菌，如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，会通过EPS的分泌促进其他微生物的附着，从而增强生物膜的整体功能。随着时间推移，微生物之间会形成高度的协作关系，并利用可获得的无机物质，使生物膜适应管道内部的环境条件。因此，理解生物膜在时间和空间上的演化对于制定有效的控制和消除策略至关重要。

然而，研究饮用水系统中的生物膜面临诸多挑战，包括其特异性、空间和时间的异质性，以及埋藏基础设施的难以接近性。为了解决这些问题，研究人员开发了多种实验设计，在受控条件下研究生物膜。常见的实验设备包括流细胞、环形反应器和CDC反应器等，这些设备操作简便，能够部分模拟饮用水管网的条件。实验通常持续数周至数月，通过持续注入当地饮用水，在可提取的表面（如试片、切口或方块）上培养生物膜，以便进行分析。研究还涉及选择与饮用水管网管道成分相符的样品材料，如铸铁、PVC、高密度聚乙烯（HDPE）、铜或不锈钢。此外，通过控制温度、流速、水力滞留时间、水龄、湍流和壁面剪切应力等参数，可以定制实验以满足特定研究目标。尽管这些方法具有诸多优势，但它们在规模上的限制导致了与实际管道系统不同的流体力学条件，同时其样品配置也无法复制实际管道中的流速分布。因此，关于在这些实验中培养的生物膜是否能够真实反映实际饮用水系统中的情况仍存在疑问。

为解决这些问题，研究者开发了使用试点系统的替代实验方法。这些系统包括平行管道段装置和循环管道装置，它们可以连接到供水系统，也可以独立运行，使用专用的泵和水箱。大多数文献中的试点系统使用小直径管道，主要研究前置供水系统，而非大规模的管网。然而，一些研究者已经开始在饮用水管网的试点实验室中进行相关研究。例如，英国谢菲尔德大学的研究人员使用了三个试点规模的HDPE管道循环系统，以研究生物膜和水质问题，并复制了饮用水管网的水力和水质条件。加拿大多伦多皇后大学的研究人员则使用了两个试点规模的PVC管道循环系统，以研究生物膜在存在和不存在情况下的颗粒物积累和迁移。最近，比利时根特大学的研究人员开发了三个PVC管道循环系统（DN 80 mm），用于研究饮用水系统中的生物膜和颜色变化问题。

除了这些实验装置，研究饮用水系统中生物膜的方法也多种多样且缺乏标准化。通过显微镜或流式细胞仪进行细胞计数是最常用的方法，尽管研究指出EPS可构成生物膜的高达90%。此外，一些研究表明，生物膜会根据环境条件调节EPS的产量，使得EPS与细胞的比例成为一种高度变化且不可靠的替代指标。另一种常用方法是ATP测量，它能够提供有关生物膜活性的重要信息，但并不一定与生物膜中的总有机物含量相关。分子技术，如定量PCR（qPCR），则通过靶向细菌的16S rRNA基因或真菌的ITS区域来评估生物膜。这些方法在结合DNA测序后显著提升了我们对生物膜的理解。然而，DNA可能来自活细胞、死细胞、EPS或被包裹的外部有机材料，这使得来源识别和DNA含量与生物膜数量的定量估计变得困难。

一些研究还通过显微镜成像技术对生物膜进行定性描述，如通过计数生物膜的簇状结构或直接在试片上使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。这些技术提供了有价值的结构信息，但在生物膜的定量分析方面存在局限。例如，显微镜下的体积计算容易出现误差，且缺乏密度信息，使得体积难以转化为质量。因此，标准化的生物膜表征方法仍是一个研究空白，尤其是在将实验结果转化为实际应用时。

此外，研究指出生物膜与沉积物的相互作用对于管理饮用水质量至关重要。生物膜的EPS具有很强的附着力，能够抵抗高剪切力，并通过生物工程方式从水流中捕获资源。有研究假设生物膜的EPS增强了悬浮颗粒在水流中的附着能力，从而促进其在管道壁上的沉积。然而，沉积物的存在也可能为生物膜的发展提供有利环境，因为它们可以保护微生物免受水流的水力影响。这些相互作用常被提及为饮用水系统中材料层积聚的主要驱动因素，并且是客户投诉的主要原因之一。

生物膜对清洗策略（如冲洗）的高抵抗力也被认为影响了管道的清洁效果，同时加速了材料层在管道壁上的重新形成，从而增加了水质恶化事件的风险。然而，研究生物膜EPS与材料积聚关系的主要挑战在于，难以在全规模系统中控制生物膜的生长条件，并且由于环境变量众多，几乎无法在实际系统中复现实验条件。

为解决这一问题，本研究提出了一种使用试点规模设施的替代实验方法，以更有效地研究生物膜的物理特性。在饮用水系统中，开发可靠且能够定量表征生物膜生长的方法对于风险评估和水质管理至关重要。因此，本研究旨在定量和定性地分析早期生物膜在试点规模、受控的PVC饮用水系统中的生长和迁移行为。具体目标包括：（1）研究生物膜在饮用水管道的纵向和环向位置的生长行为；（2）研究生物膜在冲洗过程中受到高剪切力时的迁移行为。

实验采用了一种替代的生物膜培养方法，即从当地自来水系统中获取微生物浓集液，并将其引入管道循环系统。该方法不仅加速了清洁管道表面的微生物定植，还提高了未来实验的可重复性。实验分为两个阶段：28天的生物膜生长阶段和冲洗阶段。在生长阶段，通过连续注入营养物质，促进了生物膜的形成。在冲洗阶段，通过提高流速，观察生物膜的迁移情况。此外，实验采用双独立管道循环系统（A和B），以确保实验条件的一致性。

实验前，管道循环系统A和B的湿表面均使用20 mg/L的自由氯溶液进行消毒，接触时间为24小时。随后，管道循环系统以15升每秒的流速用Kingston的饮用水进行冲洗，以去除可能在水箱和泵的吸入/排出管道中积累的生物膜和其他物质。为降低背景氯浓度，向管道循环系统中加入了硫代硫酸钠，使氯浓度降至零。在接下来的24小时内，管道循环系统的水质条件稳定下来，为生物膜的生长提供了良好的环境。

实验的初始细菌培养液（IBB）通过一个定制的过滤系统从Kingston的饮用水中连续收集。该系统包括一个水加热器，以及两个活性炭过滤器，连接到当地水龙头并以0.5升每分钟的流速运行数月。水温在入口处被控制在20°C，以确保微生物的活性。第一级活性炭过滤器用于去除饮用水中的氯，第二级则用于积累微生物，使其在活性炭的高表面积上形成生物膜。尽管该系统提供了稳定的微生物输出，但由于Kingston饮用水中营养物质的浓度较低，IBB中的细胞浓度仍相对较小（<100 CFU/mL）。为获得足够的微生物以接种管道循环系统，研究人员将18升IBB与1.5升营养培养基（NutriSelect? Plus No. 3，浓度为13 g/L）混合，并在16°C下进行一周的培养。在实验开始前，通过流式细胞仪对IBB中的细胞浓度进行了三次测量，发现其为2.3×10^5个细胞/毫升。随后，将2升IBB倒入与管道循环系统连接的水箱中，以启动实验。

在生长阶段，管道循环系统的流速被设定为0.6升每秒（0.07米每秒，0.015帕），并保持不变，直到28天的生长期结束。水在水箱和管道循环系统之间连续循环，管道中的停留时间为约50分钟。这一流速代表了加拿大本地饮用水主干管道在日常运行中的平均流速。水温被维持在16°C，这是加拿大夏季饮用水系统中的典型温度。为了促进生物膜的生长，研究人员在水箱中持续注入经过灭菌的营养培养基，平均每天注入1.2毫克/升，总共注入了105克的营养培养基。在实验开始时，溶解氧（DO）的浓度接近饱和，但在实验进行两周后，DO浓度稳定在约5毫克/升。这表明系统达到了微生物呼吸消耗DO与扩散补充DO之间的平衡。在生长的后半段，由于DO浓度较低，微生物可能经历了一定的压力。这一现象在实验中得到了体现，尤其是在生物膜的生长速率和结构特征方面。

实验中还使用了荧光显微镜技术对生物膜的生长行为进行定性分析。通过固定和染色管道试片样本，研究人员能够观察到生物膜在管道壁上的分布情况。在生长的前两周，生物膜的荧光强度较高，表明微生物在管道壁上的快速附着和生长。然而，在第14天时，荧光强度明显下降，这可能与微生物群落结构的变化有关。在第21天后，荧光强度再次上升，这可能与微生物适应新的环境条件有关。此外，实验中发现生物膜主要分布在管道的倒角位置，而弹簧线和顶面位置则只有少量生物膜存在，且多为单个细胞附着。这一现象与之前的假设不同，即生物膜在管道的整个周长上均匀分布。研究认为，这可能与初始接种液中的生物膜簇有关，尽管它们的密度低于金属颗粒，但仍能够沉降到倒角位置。

在冲洗阶段，研究人员将管道循环系统的流速提高至6.5升每秒（0.7米每秒，1.2帕），以观察生物膜的迁移情况。结果表明，虽然冲洗确实导致了生物膜的脱落，但并不能完全清除管道壁上的生物膜。这与之前的研究结果一致，即即使在高剪切力下，生物膜仍能部分附着在管道壁上。此外，冲洗过程中，生物膜在上游区域脱落，并被水流带到下游区域，最终沉降到下游管道的倒角位置。这一现象在荧光显微镜图像中得到了验证，其中在第28天的管道倒角位置观察到了明显的生物膜簇，并在冲洗后在中段和出口位置出现更多的生物膜簇。这表明生物膜在冲洗过程中可能以絮状物的形式被携带，并在下游位置重新沉积。

实验还发现，尽管实验方法可能影响了生物膜的结构和组成，但它们在物理特性上仍与实际饮用水管网中的生物膜相似，例如对剪切力的抵抗力和迁移能力。这些结果为未来的研究提供了重要的数据支持，并有助于更好地理解生物膜在饮用水系统中的行为。此外，研究中使用的替代实验方法在可重复性和实验设计方面表现出色，为后续研究提供了可靠的平台。

尽管本研究提供了有价值的信息，但仍存在一些局限性。首先，实验中使用的GAC系统虽然能够去除自由氯并提供有利于微生物生长的环境，但这种环境与实际饮用水管道中的条件存在差异。实际管道中通常存在消毒剂、剪切力和低营养浓度，而实验中则采用了无氯、高营养的环境，这可能导致了不同微生物群落的形成。其次，实验时间仅限于28天，而实际饮用水系统中的生物膜通常需要数月甚至数年才能成熟。这可能影响实验结果的全面性，因为早期生物膜与成熟生物膜在结构和组成上可能存在差异。此外，实验中使用的是PVC管道，而实际饮用水管网中包含多种材料，如铸铁、高密度聚乙烯和混凝土等，这些材料的表面粗糙度和化学特性各不相同，可能影响生物膜的附着和生长。PVC管道的光滑表面与铸铁管道的粗糙表面在微生物附着和生物膜形成方面存在显著差异，这可能限制了实验结果在实际管网中的适用性。

综上所述，本研究通过一种替代实验方法，探讨了早期生物膜在PVC管道中的生长和迁移行为，揭示了其在管道壁上的分布特征以及对冲洗操作的响应。研究结果不仅有助于理解生物膜在饮用水系统中的作用，还为未来研究提供了可重复的实验平台。尽管存在一定的局限性，如实验条件与实际管网的差异以及实验时间较短，但本研究仍然为饮用水生物膜的管理提供了重要的参考依据。