超灵敏测序（SiMSen-Seq）在环境DNA分析中的应用

《Environmental DNA》：Ultrasensitive Sequencing (SiMSen-Seq) for Environmental DNA Applications

环境DNA（eDNA）分析中，下一代测序（NGS）技术通过分子标记（如UMI）校正PCR和测序错误，提升稀有物种检测灵敏度。本研究对比了SiMSen-Seq与Illumina-DADA2两种方法在海水样本中的eDNA分析效果，发现SiMSen-Seq检测到更多mOTU（1495 vs 585-578），尤其在稀有非入侵物种（如Arenigobius bifrenatus）识别中表现更优，但对某些物种（如Ciona savignyi）的丰度统计存在差异。该方法通过双PCR和UMI聚类优化，为海洋生物多样性监测和入侵物种管理提供了新思路。

　　在环境DNA（eDNA）研究中，Next-Generation Sequencing（NGS）技术的引入极大地提高了我们对生态系统中稀有物种的检测能力。然而，传统的NGS方法在捕捉低频变异时存在一定的局限性，这可能会影响对生态多样性的真实评估。为了解决这一问题，研究人员借鉴了临床领域的创新方法，如SiMSen-Seq（基于简单多重PCR的DNA分子条形码技术，用于超高灵敏度突变检测）。SiMSen-Seq通过分子条形码技术追踪单个DNA模板，从而修正PCR引发的错误和量化偏差。这项技术特别适用于需要精确识别稀有非原产物种（NIS）的场景，例如在海洋生态系统中进行生物多样性评估。

本研究将SiMSen-Seq协议应用于eDNA分析，目标是通过18S rRNA元条形码技术来提升海洋生物多样性的检测能力。与传统的Illumina MiSeq方法（称为Illumina—DADA2）以及使用DADA2生物信息学流程的SiMSen-Seq协议（SiMSen-Seq—DADA2）相比，SiMSen-Seq在检测分子操作分类单元（mOTUs）方面表现更优。具体而言，SiMSen-Seq共检测到1495个mOTUs，而Illumina—DADA2仅检测到585个，SiMSen-Seq—DADA2则检测到578个。这表明SiMSen-Seq在提升检测灵敏度方面具有显著优势。然而，在检测稀有分类单元（如某些物种的属）时，不同方法之间的表现存在差异。SiMSen-Seq能够检测到一些其他方法未能识别的物种，例如Arenigobius bifrenatus和Pseudopolydora paucibranchiata，但同时也会遗漏一些其他NIS，如Asterias amurensis和A. forbesi。这些发现表明，SiMSen-Seq在某些情况下可能更适合用于检测特定物种的种内变异，从而为种群遗传学研究提供更精确的数据支持。

随着环境DNA技术的不断进步，其在生态系统监测和生物多样性研究中的应用日益广泛。通过提取水、土壤或空气中的DNA，科学家可以无创地识别生态系统中存在的多种生物，而无需直接观察。这种技术不仅提高了研究的效率，还降低了对环境的干扰。在实际应用中，eDNA技术已被用于追踪濒危物种、检测海洋非原产物种以及评估生态系统健康状况。然而，当前的NGS方法在检测低频变异时仍面临挑战，尤其是在种内遗传多样性分析中，传统方法可能无法准确区分目标物种与其近缘种，从而导致假阴性或假阳性结果，这对环境管理和决策具有潜在影响。

为了提高检测的准确性，研究人员开发了多种改进方法，其中SiMSen-Seq是一个重要的创新。该技术通过在PCR过程中引入独特的分子标识符（UMIs），能够追踪单个DNA分子，并在后续的生物信息学分析中通过聚类算法消除PCR和测序过程中产生的错误。这种策略在医学领域已被广泛应用，例如用于癌症突变的检测和诊断。本研究首次将SiMSen-Seq技术应用于eDNA分析，以评估其在海洋生物多样性研究中的潜力。通过对比不同方法的检测结果，研究发现SiMSen-Seq在提升检测灵敏度方面表现突出，特别是在识别稀有物种和减少错误率方面。

在实验室处理过程中，所有样本均采用改进的Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit方法提取DNA。对于SiMSen-Seq协议，样本经过两轮PCR处理：第一轮PCR使用UMIs标记目标序列，以便在后续的测序过程中追踪每个DNA分子的来源；第二轮PCR则加入Illumina适配器，以便进行测序。相比之下，传统的Illumina—DADA2方法仅进行一轮PCR，将适配器直接添加到目标序列的扩增过程中。这种两步PCR策略有助于减少PCR过程中可能产生的偏差，从而提高检测的准确性和可靠性。

在生物信息学处理方面，SiMSen-Seq采用了独特的UMI聚类算法，通过将相同UMI家族的读数合并为共识读数，进一步修正PCR和测序误差。而DADA2则采用了一种不同的方法，通过分析序列的变异来识别操作分类单元（ASVs）。尽管两种方法都能有效检测到物种，但它们在结果的解释和分类上存在差异。例如，SiMSen-Seq检测到的mOTUs数量显著高于DADA2处理的样本，这可能是因为DADA2方法在处理过程中倾向于合并稀有变异，从而减少了整体的物种多样性。此外，DADA2方法还依赖于伪池化技术，即将所有样本的数据合并分析，这可能导致某些稀有物种的检测结果受到其他样本中高丰度变异的影响。

在统计分析方面，研究团队使用了多种方法，包括Venn图、回归分析和Mantel检验，以评估不同协议之间的检测一致性。结果显示，尽管所有方法在检测主要NIS方面表现相似，但在识别稀有物种时存在显著差异。例如，SiMSen-Seq能够检测到一些其他方法未能识别的物种，如Arenigobius bifrenatus和Pseudopolydora paucibranchiata，但同时也无法检测到其他一些NIS，如Asterias amurensis和A. forbesi。这种差异可能与样本的丰度、测序深度以及生物信息学处理方法有关。例如，某些稀有物种的检测可能受到测序深度不足的影响，而其他物种的检测失败可能与生物信息学处理过程中的参数设置有关。

此外，研究还发现，不同协议在检测某些物种时可能存在混淆。例如，某些NIS的序列在BLAST分析中显示为100%匹配，但它们的实际分类仍需进一步验证。这表明，尽管eDNA技术在物种识别方面具有优势，但在某些情况下仍需结合其他方法，如多标记分析或靶向物种特异性检测，以提高物种区分的准确性。例如，可以使用18S rRNA和线粒体细胞色素氧化酶I（COI）等不同标记进行联合分析，以减少因单一标记导致的分类错误。

本研究的结果表明，SiMSen-Seq在某些特定物种的检测中具有显著优势，尤其是在需要区分种内变异的场景中。然而，对于某些高丰度且容易扩增的物种，SiMSen-Seq的检测优势可能不明显，甚至可能因为成本较高而难以推广。因此，未来的研究需要进一步评估不同方法的适用性，以确定哪种技术最适合特定的研究目标。例如，可以使用模拟社区（mock communities）进行更受控的实验，从而更准确地评估不同方法的检测能力和误差率。

总之，这项研究不仅验证了SiMSen-Seq在eDNA分析中的潜力，还强调了跨学科合作的重要性。通过借鉴医学、法医学和环境科学领域的先进技术，研究人员能够开发出更高效、更准确的检测方法，从而推动生态学和生物多样性研究的发展。同时，研究也指出，生物信息学处理方法对结果的影响不容忽视，因此在实际应用中需要结合实验设计和数据分析方法，以确保检测结果的可靠性。未来，随着技术的不断进步，eDNA分析有望在更多领域发挥作用，包括生物安全监测、生态管理以及全球范围内的生物多样性保护。