环境DNA时空变异的驱动因素：以一种罕见的水生蝾螈——东部地狱蝾螈（Cryptobranchus alleganiensis alleganiensis）为例的评估

《Environmental DNA》：Drivers Behind Spatiotemporal Variation in Environmental DNA: An Assessment Using a Rare Aquatic Salamander, the Eastern Hellbender (Cryptobranchus alleganiensis alleganiensis)

东岸大鲵的eDNA时空变异及环境因素影响分析，通过季节和精细空间采样结合多元广义线性混合效应模型，发现繁殖季节eDNA浓度和检测率显著升高，但去除正场控制站后季节差异消失，空间变异不显著。总有机碳（TOC）是唯一显著抑制eDNA浓度和检测率的因素，pH和温度呈现弱关联。研究表明需多次采样和考虑环境变量以优化eDNA监测策略。

　　环境DNA（eDNA）采样已经成为监测稀有和数量下降的水生物种的重要工具。然而，eDNA信号在时间和空间上的变化可能导致结果出现偏差，而这些变化背后生物学和环境因素尚未完全明确。本研究聚焦于一种稀有的水生两栖动物——东方地狱螈（*Cryptobranchus alleganiensis alleganiensis*），探讨其在不同季节和细尺度（<100米）纵向空间中的eDNA浓度和检测情况。我们还应用了多元广义线性混合效应模型，分析物理和水文特征如何影响eDNA浓度估计和检测率。研究结果表明，两种指标在地狱螈繁殖季节都会出现显著波动，而在其他季节则相对较低。这种波动主要由一个地狱螈密集且活跃繁殖的地点所驱动，一旦排除该地点，时间上的eDNA信号变化就不再明显。此外，我们没有观察到细尺度空间上的eDNA分布模式，但浓度和检测率在站点内的时空重复样本中表现出高度变异性，这强调了在多个尺度上采集重复eDNA样本的重要性。仅PCR抑制剂对浓度和检测率产生了显著的负面影响，但流速仍表现出一般性的负相关关系。表面水温与pH值的增加对eDNA浓度有微弱的关联，但并未影响检测率。本研究为理解eDNA时空变化的驱动因素提供了重要知识，有助于优化地狱螈及其他稀有水生生物的eDNA采样策略，从而更准确地推断其种群动态。

eDNA采样在生态学和生物多样性研究中发挥着越来越重要的作用。然而，由于eDNA信号可能受到多种生物和环境因素的影响，其不确定性对科学推断构成挑战。eDNA的浓度和检测率在不同季节和不同地点可能有显著差异，这种差异可能源于物种的行为、生理变化、种群密度以及水文条件的波动。例如，某些物种在繁殖季节会释放大量DNA，从而导致eDNA浓度在短时间内显著上升。此外，水体中的物理和化学特征，如流速、温度、pH值、总有机碳（TOC）和电导率，也会影响eDNA的捕获和检测。理解这些因素如何相互作用，对于提高eDNA采样方法的准确性和可靠性至关重要。

在本研究中，我们关注的是东方地狱螈，这是一种高度隐秘且栖息于高阶（>3 Strahler）溪流系统的稀有物种。该物种在繁殖季节（9月至10月）表现出强烈的活动性，雄性会积极捍卫巢穴并进行外部受精，这一行为显著增加了eDNA的浓度。然而，在非繁殖季节，eDNA浓度则显著降低。这种时间上的波动可能与地狱螈种群规模的季节性变化以及水文条件（如流速和水体悬浮颗粒的重新分布）有关。我们发现，在所有90个采样点中，只有22个点检测到了地狱螈的eDNA，并且这些点的检测率在繁殖季节显著高于其他季节。这一结果表明，eDNA浓度和检测率的变化主要与繁殖行为相关，而不是物种的普遍分布。

在空间尺度上，我们并未发现显著的eDNA分布模式。然而，在同一个站点的不同空间重复采样中，eDNA浓度和检测率存在高度变异性。例如，在繁殖季节，一个站点的三个空间重复样本的eDNA浓度分别为154.3、11.0和67.7 pg/μL，而在孵化季节，一个站点的两个重复样本中未检测到eDNA。这种细尺度的空间变化可能与DNA的分布不均、水体中的抑制因子（如有机物）或水文条件（如流速和涡流）有关。因此，在采样设计中，应考虑在多个空间尺度上进行重复采样，以更准确地捕捉eDNA的动态变化。

我们发现，总有机碳（TOC）是影响eDNA浓度和检测率的唯一显著因素。TOC主要来源于土壤和植被中的有机化合物，是环境样本中常见的污染物。某些有机化合物，如腐殖酸、富里酸和单宁酸，已被证实是PCR的抑制剂，会显著影响DNA扩增效率和整体检测成功率。TOC的增加通常会导致eDNA浓度的下降，这可能与这些抑制剂对PCR反应的干扰有关。此外，我们还观察到流速与eDNA浓度和检测率之间存在一般性的负相关关系。流速的增加可能通过稀释效应降低eDNA的可用性，从而影响检测率。然而，这种关系在不同模型中的表现并不一致，可能与样本量较小有关。

除了TOC和流速外，我们还发现水温与eDNA浓度之间存在微弱的正相关关系，而pH值的增加对eDNA浓度有总体的正影响。然而，这些因素对检测率的影响并不显著，这可能是因为检测率主要受到PCR抑制剂的影响，而非eDNA本身的浓度。例如，在酸性环境中，pH值较低可能加速DNA的降解，从而降低eDNA的浓度。然而，由于我们的样本pH值较为中性（平均值为6.7），这种影响可能不显著。同样，水温的升高通常会加速DNA的降解，但在我们的研究中，水温在繁殖季节的升高并未显著降低eDNA的浓度，这可能与采样点的水温梯度有关，即我们采集的样本更接近底质，而非水面。

此外，我们还观察到eDNA浓度和检测率之间存在显著的非线性关系。随着eDNA浓度的增加，检测率逐渐上升，最终趋于稳定。这种关系在多个模型中均被验证，表明当eDNA浓度达到一定阈值时，检测率才会显著提高。这一发现对于优化eDNA采样策略具有重要意义，尤其是在稀有物种的监测中，应确保采样点的eDNA浓度足够高，以提高检测成功率。

本研究的结果表明，为了准确推断稀有物种的种群动态，研究人员需要在多个时间和空间尺度上进行重复采样。这不仅有助于捕捉eDNA的时空变化，还能减少因环境因素导致的检测偏差。例如，当eDNA浓度较低时，即使在重复采样中，检测率也可能不理想。因此，建议在采样过程中使用多个PCR重复，以提高检测的准确性。此外，应避免在TOC水平较高的环境中采样，尤其是在秋季，因为高TOC可能显著影响PCR反应的效率。

总的来说，本研究揭示了eDNA信号在时间和空间上的复杂变化，并强调了理解这些变化背后的生物学和环境因素的重要性。对于稀有物种的监测，应在繁殖季节进行采样，以最大化检测概率。同时，应考虑多种环境因素对eDNA浓度和检测率的影响，以制定更有效的采样策略。这些发现不仅有助于优化东方地狱螈的eDNA监测方法，也为其他稀有水生生物的eDNA研究提供了重要的参考。