基于环境RNA的宏转录组学作为新型生物监测工具：以草甘膦类除草剂对淡水真核生物群落影响为例

《Molecular Ecology》：Environmental RNA-Based Metatranscriptomics as a Novel Biomonitoring Tool: A Case Study of Glyphosate-Based Herbicide Effects on Freshwater Eukaryotic Communities

环境RNA（eRNA）作为非侵入性监测工具，能够反映生物群落的功能基因表达变化。本研究通过在户外 mesocosms 中施加草甘膦基 herbicide（GBH）处理，利用 eRNA 代谢组学分析显示，GBH 显著改变了浮游植物、原生动物等9个主要类群的相对转录丰度，其中 Branchiopoda 和 Insecta 转录丰度上升，而其他类群下降。差异表达基因主要涉及氧化应激响应（如谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化相关基因）、解毒途径（如细胞色素P450系统）及光合作用相关通路。研究表明，eRNA 代谢组学能有效捕捉复杂淡水群落的功能基因表达变化，为污染物毒性评估和生态健康监测提供新方法。

　　本研究聚焦于利用环境RNA（eRNA）进行环境生物监测的潜力，特别是在评估环境压力对复杂淡水生态系统中多种真核生物的基因转录影响方面。传统上，生物多样性调查主要依赖形态学和分子生物学方法，这些方法虽然能够提供物种组成和多样性的关键信息，但往往难以揭示生物体的生理状态，而这些状态是生态系统健康的重要指标。随着环境RNA技术的发展，它为环境评估提供了新的可能性，能够提供超越物种检测的额外信息，包括功能性基因的表达水平。这种能力使得eRNA成为一种更有潜力的工具，用于监测和评估环境变化对生态系统的影响。

研究中采用了一种户外的微宇宙（mesocosms）实验方法，以评估一种基于草甘膦的除草剂（GBH）对多种淡水真核生物基因转录的急性影响。选择这一方法是因为GBH在农业中的广泛应用，已经导致了水体污染，并对许多物种造成了直接的死亡影响，同时也减少了浮游生物群落的物种多样性。通过将eRNA与真核生物的基因表达模式联系起来，研究者希望揭示这些生物在面对环境压力时的生理反应。这种转录组分析方法，能够捕捉到不同生物类群在特定环境条件下的基因表达变化，从而为环境健康状况提供新的视角。

实验设计方面，研究团队在加拿大魁北克省蒙特圣希尔地区的一个受保护森林中的湖水样本中建立了四个微宇宙系统，每个系统容量约为1000升。这些微宇宙系统在实验开始前被放置了大约六周的时间，以确保生物群落能够稳定。随后，团队在每个微宇宙中加入了特定浓度的草甘膦，以模拟其在自然水体中的影响。实验结束后，采集了处理前后的水样，并通过过滤和RNA提取等步骤，获得了用于后续分析的环境RNA样本。在实验过程中，研究人员特别关注了样本采集和处理过程中RNA的完整性，因为RNA在环境中降解较快，且其质量对于后续的转录组分析至关重要。

在数据处理方面，研究团队采用了多种生物信息学工具和流程，以确保数据的准确性和可靠性。首先，通过Trimmomatic对原始序列进行了质量过滤，去除了低质量的读数和Illumina适配器。接着，利用SortMeRNA去除了核糖体RNA（rRNA）的序列，因为这些序列在转录组分析中可能掩盖了其他重要基因的表达信息。去除了rRNA的读数随后被用于构建转录组拼接，以形成不同的基因片段（contigs）。为了进一步提高分析的准确性，团队还利用了DIAMOND和MEGAN等工具对这些contigs进行了分类学注释，并结合KEGG数据库进行了功能注释。这些步骤为后续的基因表达分析奠定了坚实的基础。

在基因表达分析方面，研究团队对九个主要的真核生物类群进行了比较，包括浮游植物、浮游动物、纤毛虫和水生昆虫等。通过线性混合效应模型（LMM）和稳健线性混合效应模型（rLMM）对这些类群的基因表达变化进行了统计分析，以评估草甘膦处理对它们的影响。结果表明，大多数真核生物类群的相对转录丰度在处理后发生了显著变化，而较长生命周期的生物类群表现出更高的耐受性。此外，研究发现草甘膦处理导致了更多的基因下调而非上调，这可能与其急性毒性有关。许多下调的基因与氧化应激反应和解毒相关，表明这些生物在面对草甘膦暴露时启动了相应的防御机制。

尽管eRNA在环境监测中展现出巨大的潜力，但其应用仍然面临诸多挑战。例如，环境RNA的获取和分析过程涉及复杂的实验步骤和数据分析方法，而目前的参考数据库和基因注释工具在处理非模式生物时存在一定的局限性。此外，由于RNA在环境中降解迅速，这使得在不同时间点之间的比较变得复杂。尽管如此，本研究的结果表明，基于eRNA的宏转录组分析能够有效地捕捉到不同生物类群在环境压力下的转录响应，为环境监测提供了新的方法。

研究团队还注意到，某些生物类群的相对转录丰度在草甘膦处理后增加了，这可能与其生命周期较长有关。这类生物在环境中的存在时间更长，因此可能在处理后仍然活跃，而较短生命周期的生物则可能因为草甘膦的毒性而减少其转录丰度。这些发现为理解不同生物对草甘膦的响应提供了新的视角，同时也表明基于eRNA的宏转录组分析在环境监测中的重要性。

此外，研究团队还讨论了基于eRNA的宏转录组分析在实际应用中可能面临的挑战。例如，如何准确地进行分类学和功能注释，如何处理由于生物群落组成变化而导致的基因表达差异，以及如何区分由环境压力引起的转录变化与由生物死亡释放的RNA所导致的信号。这些问题需要进一步的研究和优化，以提高基于eRNA的环境监测方法的准确性和可靠性。

总的来说，本研究展示了基于环境RNA的宏转录组分析在评估环境压力对淡水生态系统中多种真核生物基因转录的影响方面的潜力。通过这一方法，研究人员能够捕捉到更广泛的生物信息，包括基因表达模式和生理状态的变化，从而为环境监测提供更全面的数据支持。未来的研究可以进一步探索这种方法在不同生态系统和环境压力下的适用性，并结合其他生物监测方法，如形态学分析和环境DNA（eDNA）测序，以获得更全面的生态评估。