来自病原真菌的分泌蛋白漆酶lac8能够激活植物蛋白14-3-3和富含亮氨酸重复序列的受体样蛋白LRR-RLP1，从而触发芒果的免疫反应

《Molecular Plant Pathology》：A Secretory Protein Laccase lac8 From Pathogenic Fungi Activates Plant Protein 14-3-3 and Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Protein LRR-RLP1 to Trigger Mango Immunity

芒果炭疽病菌分泌漆酶Cglac8通过激活宿主MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1蛋白介导的免疫反应增强抗病性，其机制涉及氧化应激和植物激素调控，为分子育种提供新靶点。

　　植物在面对病原菌感染引发的生物胁迫时，会启动复杂的抗性机制。在这项研究中，我们识别并验证了来自炭疽菌（*Colletotrichum gloeosporioides*）的一种分泌型漆酶Cglac8在芒果（*Mangifera indica*）感染过程中的关键作用，同时发现Cglac8能够激活宿主的先天免疫机制。通过酵母双杂交、双分子荧光互补和pull-down实验，我们证实了Cglac8与MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用。这些相互作用的蛋白质MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1通过促进活性氧（ROS）爆发和植物激素的生物合成，正向调控芒果对炭疽菌的抗性。当Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1蛋白被共同过表达时，芒果对炭疽菌的抗性显著增强。我们的研究揭示了宿主植物对抗炭疽菌的新防御机制，为芒果抗病分子育种提供了理论基础。Cglac8的双重作用可能反映了宿主与病原体在共同进化过程中的平衡机制。

植物在自然环境中面临诸多挑战，其中病原体感染是威胁其生长发育的重要因素之一。为应对病原体带来的生物胁迫，植物进化出了多种复杂而有效的抗性机制。植物感知微生物相关分子模式（MAMPs）并激活相应的免疫反应是其适应环境的关键因素之一。细胞表面的模式识别受体（PRRs）在检测MAMPs中起着重要作用，从而启动模式触发免疫（PTI）。受体样激酶（RLKs）和受体样蛋白（RLPs）属于PRRs家族，参与植物的防御与发育过程。RLKs主要负责调控识别和信号转导，而RLPs的分子机制仍不明确。已有研究表明，RLPs缺乏细胞内激酶结构域，需要与含有激酶结构域的其他蛋白如SOBIR1相互作用，以激活下游信号。例如，LRR-RLP RXEG1通过LRR结构域识别*Phytophthora sojae*的XEG1分子，然后与LRR受体样激酶BAK1和SOBIR1形成复合物，传递XEG1诱导的防御信号。此外，在*Arabidopsis thaliana*、*Oryza sativa*和*Solanum lycopersicum*中，LRR-RLK SOBIRs分别与LRR-RLPs（ReMax、OsRLP1和Cf-4）结合，这些RLK/RLP复合物在免疫反应中发挥重要作用。然而，目前关于芒果中LRR-RLPs的识别和分子机制尚不清楚。LRRs不仅在植物免疫中起关键作用，还参与植物的生长发育过程。例如，在*Arabidopsis*中，LRR-RLK AtSERK1通过与磷酸酶AtCDC48的相互作用介导胚胎发育，而AtCDC48属于*Arabidopsis*的14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白作为植物免疫中心和支架蛋白，其功能被病原体效应子所调控。它能够增强植物细胞的抗病能力，但同时也被发现具有细胞外的功能。

植物的抗病能力与其对病原体的识别和响应密切相关。许多由真菌引起的植物疾病，如由*Puccinia graminis* f. sp. *tritici*引起的麦类黑粉病和由*Cladosporium fulvum*引起的番茄叶霉病，严重威胁粮食安全并扰乱自然生态系统。丝状病原体在入侵宿主时会分泌效应子以抑制宿主免疫并导致疾病。例如，*P. graminis* f. sp. *tritici*的PSTha5a23效应子通过抑制胼胝质沉积和程序性细胞死亡来抑制PTI，而*Cladosporium fulvum*的Avr2效应子则在携带对应R蛋白Cf-2的番茄品种中抑制半胱氨酸蛋白酶并诱导过敏反应（HR）。炭疽菌则会分泌多种酶（如漆酶、果胶酶、纤维素酶等）和其他物质以降解植物细胞壁，促进其侵染。漆酶（EC 1.10.3.2）是一种氧化还原酶，具有多酚氧化酶活性，通常以多基因家族形式存在，是真菌的重要致病因子。在病原体侵染过程中，漆酶可以破坏植物细胞壁，氧化宿主产生的酚类和非酚类物质，从而促进病原体的定殖和生长。其在不同植物-病原真菌组合中具有多样的功能，甚至在同一种病原体中也存在功能差异。然而，目前对炭疽菌中漆酶的具体作用仍不明确。

在这项研究中，我们识别出炭疽菌分泌的Cglac8作为其重要致病因子，并发现其能够激活宿主的先天免疫反应。通过酵母双杂交、双分子荧光互补和pull-down实验，我们证实了Cglac8与MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用。这些蛋白质在芒果中具有组织特异性表达，且在体内和体外均能形成稳定的相互作用复合物。此外，通过分子对接分析，我们进一步验证了Cglac8与MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的结合模式。这些结果表明，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在芒果中存在复杂的相互作用机制。

为了进一步探讨Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在芒果抗炭疽菌中的功能，我们构建了过表达的*Arabidopsis*株系（Cglac8-OE1、MiLRR-RLP1-OE2和Mi14-3-3-D1-OE2）。结果表明，这些过表达株系在感染炭疽菌后表现出更显著的免疫反应和抗病能力，包括更轻微的症状、更小的病斑直径和更少的炭疽菌积累。此外，这些株系中ROS（活性氧）的爆发水平显著高于野生型。我们还测量了植物激素（如水杨酸SA、乙烯ETH和茉莉酸MeJA）的含量以及相关基因的表达水平。结果显示，过表达株系中的植物激素含量和相关基因的表达水平均显著高于对照组。这些结果表明，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1均参与宿主对炭疽菌的感染响应。

进一步研究表明，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的联合过表达在芒果中表现出最强的抗病效果。其中，MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在增强Cglac8激活的芒果免疫反应中起着关键作用。通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术，我们构建了沉默MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的芒果植株，并发现这些沉默植株对炭疽菌的感染表现出更高的病斑面积和更高的炭疽菌积累。同时，这些沉默植株中SA、ETH和MeJA的含量显著低于对照组，且相关抗病基因的表达水平也受到影响。这些实验结果进一步支持了Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在芒果抗炭疽菌中的协同作用。

综上所述，我们的研究揭示了Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在芒果抗炭疽菌中的重要作用。Cglac8不仅作为致病因子促进炭疽菌的感染，同时还能通过激活宿主的免疫反应来增强其抗病能力。这种双重作用可能反映了宿主与病原体在共同进化过程中的一种平衡机制：Cglac8通过特定的致病相关功能（如细胞壁降解）促进感染，而同时无意中激活了宿主的免疫反应。这一相互作用展示了炭疽菌在致病策略中的一种权衡现象。类似地，一些真菌效应子，如香蕉黄萎病菌*Fusarium oxysporum* f. sp. *cubense*的FocSIX1A和FocSIX6，通过在香蕉的木质部组织中过表达，能够增强对血管病的抗性。而另一些真菌分泌的漆酶，如*Ustilaginoidea virens*的UgsL，则通过抑制PTI反应来增强植物对病原体的易感性。这可能与UgsL和Cglac8在生物功能上的显著同源性差异有关。

我们的研究还表明，Cglac8与MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用是芒果抗炭疽菌的关键机制之一。MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1能够通过与Cglac8的结合，增强宿主的免疫反应。这一发现不仅有助于理解芒果如何识别和监控病原体，也为植物抗病分子育种提供了新的思路。通过构建Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的过表达组合，我们发现这些蛋白质在体内和体外均能形成稳定的相互作用复合物，并且其协同作用显著增强了芒果对炭疽菌的抗性。这些结果表明，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用可能构成了一个完整的防御信号传导通路。

此外，我们还发现，Cglac8在芒果中具有分泌特性，并且其分泌信号肽对功能至关重要。通过荧光显微镜观察，我们发现Cglac8在细胞质和细胞核中均有表达，并且能够被分泌到细胞外。这种分泌特性使其能够与宿主细胞表面的受体相互作用，从而激活免疫反应。通过进一步的实验，我们发现Cglac8的过表达显著增强了芒果对炭疽菌的抗性，包括降低病原体的生物量、增加ROS的积累以及促进植物激素的合成。MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的表达则通过调节植物激素的合成和信号传导，增强了芒果的抗病能力。这些结果表明，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用是芒果抗炭疽菌的重要机制之一。

我们还发现，Cglac8在芒果中具有双重功能：一方面，它作为致病因子促进炭疽菌的侵染；另一方面，它通过激活宿主的免疫反应，间接增强抗病能力。这种双重作用可能反映了宿主与病原体在共同进化过程中的一种平衡策略。例如，某些真菌效应子虽然具有致病性，但它们的表达也可能被宿主的免疫系统识别并引发防御反应。这种机制在植物抗病研究中具有重要意义，因为它揭示了病原体如何通过其分泌的物质与宿主的免疫系统相互作用，从而影响植物的抗病能力。

在实验方法上，我们采用了多种技术手段，包括酵母双杂交、双分子荧光互补、pull-down和分子对接分析，以验证Cglac8与MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用。此外，我们还通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术，验证了MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在芒果抗病中的作用。这些实验不仅确认了Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1之间的相互作用，还揭示了它们在抗病反应中的协同效应。

为了进一步研究这些蛋白质在芒果抗病中的具体作用，我们还进行了植物激素含量的测定和相关基因的表达分析。结果显示，过表达Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的芒果叶片中，SA、ETH和MeJA的含量显著高于对照组。同时，这些基因的表达水平也呈现上升趋势。这些结果表明，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的协同作用在芒果抗炭疽菌中具有重要作用。此外，我们还发现，Mi14-3-3-D1可能在调控Cglac8与MiLRR-RLP1之间的相互作用中起着关键作用，从而增强芒果的抗病能力。

综上所述，我们的研究揭示了Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1在芒果抗炭疽菌中的重要性。这些蛋白质不仅能够促进植物激素的合成和信号传导，还能通过激活ROS的爆发，增强宿主的免疫反应。通过这些机制，Cglac8、MiLRR-RLP1和Mi14-3-3-D1的协同作用显著提高了芒果对炭疽菌的抗病能力。这一发现为未来植物抗病分子育种提供了新的思路，并有助于开发针对炭疽菌的新型抗病策略。同时，这些结果也为理解植物与病原体之间的相互作用提供了新的视角，有助于进一步探索植物抗病机制的复杂性。