基于填充纤维固相萃取技术的人尿液中大豆异黄酮生物标志物的新检测方法

《Food Science & Nutrition》：A New Detection Method for the Biomarkers of Soybean Isoflavones in Human Urine on the Basis of Packed-Fiber Solid-Phase Extraction

大豆异黄酮尿液中检测方法研究基于电纺纳米纤维固相萃取结合紫外分光光度法，优化纤维类型、盐离子浓度、洗脱液及用量，显著降低基质干扰并提高检测灵敏度，为膳食评估提供新工具。

　　近年来，随着人们对健康饮食和营养摄入的关注不断加深，传统的膳食评估方法逐渐暴露出其局限性。这些方法通常依赖于调查人员的主观判断，如24小时膳食回顾法或食物频率问卷，虽然在一定程度上可以提供饮食信息，但它们在准确性上存在较大挑战，尤其是在记录短期记忆时容易出现偏差。此外，这些方法往往需要专业的培训和较高的参与度，限制了其在大规模人群研究中的应用。因此，寻找一种更加客观、高效的膳食评估工具成为科研界的重要课题。

在这一背景下，生物标志物作为一种能够反映个体实际摄入情况的客观指标，受到了越来越多的关注。其中，大豆异黄酮因其独特的生理活性和广泛的应用价值，被认为是评估大豆摄入水平的重要生物标志物之一。大豆异黄酮属于植物性雌激素，其化学结构与人体内分泌系统中的雌二醇非常相似，因此在特定条件下可以表现出类似雌激素的生物效应。这些效应不仅有助于缓解更年期症状，还能调节内分泌系统，降低胆固醇水平，减少动脉粥样硬化的风险，甚至在预防某些癌症方面发挥积极作用。同时，研究表明，尿液中大豆异黄酮的排泄水平与摄入量之间存在显著的相关性，因此，通过检测尿液中的异黄酮含量，可以较为准确地评估个体的膳食摄入情况。

然而，尿液样本的复杂性给异黄酮的检测带来了较大挑战。尿液中除了目标物质，还含有多种干扰成分，如尿素、无机盐、尿酸、肌酐等，这些成分可能影响检测的准确性。同时，异黄酮在尿液中的浓度往往处于纳摩尔级，这使得检测的灵敏度和选择性成为关键问题。传统的检测方法如高效液相色谱（HPLC）和液质联用技术（LC-MS/MS）虽然具有较高的灵敏度和选择性，但设备昂贵、操作繁琐，难以在实际应用中普及。相比之下，紫外分光光度法（UV-Vis）因其操作简便、成本低廉、检测时间短等优点，成为一种具有潜力的替代方法。

为了提高异黄酮检测的准确性与效率，本研究采用了一种基于纳米纤维固相萃取（SPE）的新型检测方法。通过电纺技术制备了多种类型的纳米纤维材料，并将其作为固相萃取的吸附剂，用于尿液样本的预处理。纳米纤维因其具有较大的比表面积、较高的孔隙率和良好的吸附性能，被认为是替代传统吸附材料的理想选择。此外，纳米纤维还具有可重复使用、减少有机溶剂消耗等环保优势，这使其在绿色分析方法的发展中占据重要地位。

在实验过程中，首先对纳米纤维的制备工艺进行了优化。研究团队选择了一种由聚苯乙烯（PS）和不同添加剂（如聚丙烯腈（PAN）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚醚砜（PES）等）组成的混合溶液，通过调整溶剂比例、电纺电压、接收距离和环境湿度等参数，得到了具有理想结构和吸附性能的纳米纤维材料。通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对纳米纤维的形态进行了表征，结果显示，10% PS纳米纤维具有较高的孔隙率和良好的表面结构，能够有效吸附异黄酮分子，同时减少杂质的干扰。

在样本预处理方面，本研究采用了一种优化的提取方案。首先，将尿液样本与甲醇-水混合液（体积比4:1）进行超声提取，以确保目标物质能够充分释放。随后，通过0.22 μm有机相滤膜对提取液进行过滤，以去除可能存在的杂质。为了进一步提高检测的灵敏度和准确性，采用自制的纳米纤维填充固相萃取柱进行纯化和富集。该柱体通过轻度压缩纳米纤维，确保其在样本流经时能够均匀吸附异黄酮，从而提高富集效率。

在检测波长的选择上，研究团队通过紫外分光光度法对异黄酮的吸收特性进行了系统分析。实验结果表明，异黄酮在260 nm处具有最大吸收峰，这一发现与文献报道一致，为后续的检测提供了可靠的波长依据。同时，通过比较不同提取液的性能，最终选择了甲醇-乙腈-醋酸（体积比50:45:5）作为最优的洗脱液，以提高目标物质的回收率并减少杂质的干扰。

为了验证该方法的可行性，研究团队对多个参数进行了系统优化，包括纳米纤维的填充量、盐离子的种类与浓度、提取时间等。实验结果显示，当纳米纤维填充量为12 mg时，能够达到最佳的吸附与富集效果。此外，使用1.25 × 10?3 g/mL的十二烷基硫酸钠（SDS）作为盐离子，可以显著提高异黄酮的回收率。提取时间的优化表明，当提取时间为7分钟时，能够实现异黄酮的充分吸附和富集，从而提高检测的准确性。

在方法验证过程中，研究团队对异黄酮的标准曲线进行了建立，并在0.05–30 μg/mL的浓度范围内验证了该方法的线性关系和检测限。结果显示，该方法在目标浓度范围内具有良好的线性关系（R2 ≥ 0.99），并且检测限（LOD）为0.01 μg/mL，表明其具有较高的灵敏度。同时，通过比较不同样本的回收率，发现该方法在不同浓度下均能实现较高的回收率（70.5%–82.5%），表明其在实际应用中具有较高的可靠性和重复性。

此外，研究团队还评估了该方法在复杂基质中的表现。通过将标准溶液与尿液基质进行比较，发现该方法能够有效减少基质对检测的干扰，使得异黄酮的吸收峰更加明显，提高了检测的准确性和稳定性。这一结果表明，该方法在实际应用中具有较强的抗干扰能力，能够在复杂尿液基质中实现对异黄酮的精准检测。

为了进一步验证该方法的适用性，研究团队还对实际样本进行了检测。通过对六种食品（如大豆、绿豆、豆蔻、黑豆、保健产品和豆制品）中异黄酮含量的测定，发现大豆是异黄酮含量最高的食物，是摄入异黄酮的主要来源。在尿液样本检测中，研究团队分析了三名男性和三名女性的样本，发现男性样本中未检测到异黄酮，而女性样本中仅有一名检测到较低浓度的异黄酮。这可能与性别差异、饮食习惯、摄入量等因素有关，但这一结果表明，该方法在实际样本中的检测能力得到了验证，并具有良好的应用前景。

在环保和可行性方面，研究团队采用了一系列绿色分析指标对本方法进行了评估。通过AGREEprep、ComplexMo-GAPI和BAGI等工具，对方法的环境影响、操作便捷性和实际应用性进行了综合分析。结果显示，该方法在减少有机溶剂使用、提高样本处理效率、降低污染等方面表现出显著优势。其操作步骤简单，所需的样本量较小，且能够实现快速检测，这使得该方法在实际应用中更加经济和环保。同时，该方法的整个流程可以在不依赖额外加热或冷却的条件下完成，进一步降低了能源消耗。

综上所述，本研究开发了一种基于纳米纤维固相萃取和紫外分光光度法的新型异黄酮检测方法。该方法不仅具有较高的灵敏度和准确性，还能够在复杂尿液基质中有效去除杂质，提高目标物质的富集效率。同时，该方法在操作简便、环保性和经济性方面表现出色，为大豆摄入量的客观评估提供了新的技术路径。未来，随着该方法的进一步优化和推广，有望在公共健康、临床研究以及膳食调查等领域发挥重要作用，为精准营养和健康评估提供更加科学、可靠的依据。