意大利开心果中的曲霉菌：利用环介导等温扩增法对主要产黄曲霉毒素菌种的鉴定与检测

《Food Science & Nutrition》：Aspergillus in Italian Pistachios: Characterization and Detection of Major Aflatoxigenic Species With a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay

黄曲霉毒素B1检测：意大利开心果中Aspergillus flavus和A. parasiticus的LAMP方法开发与验证。研究分离出117株Aspergillus，其中93.13%为A. flavus，所有目标菌株均产AFB1（最高达9926 ng/mL）。采用nor1基因设计LAMP引物，灵敏度达0.03 pg DNA，直接检测真菌（0.5 spores/g）有效，引物空气干燥后稳定性达45天。

　　在我们日常生活中，坚果作为一种健康食品，不仅提供了丰富的营养，还因其独特的风味受到广泛欢迎。然而，某些坚果在采收、储存及运输过程中容易受到微生物污染，尤其是产黄曲霉毒素的霉菌。这些霉菌在适宜的环境条件下可以迅速繁殖，并产生对人体有害的黄曲霉毒素，这不仅影响坚果的品质，还可能对消费者的健康构成威胁。因此，对于坚果中霉菌的快速、准确检测显得尤为重要，特别是在国际贸易中，许多国家对黄曲霉毒素含量设定了严格的监管标准。

黄曲霉毒素主要由某些霉菌种类产生，其中最为重要的是属于黄曲霉属（*Aspergillus*）的几个物种，特别是*Aspergillus flavus*和*Aspergillus parasiticus*。这两种霉菌不仅在生产过程中表现出较高的毒素生产能力，而且在实际应用中具有较大的经济影响。它们能够在多种坚果中生长，尤其是在储存条件不佳时更容易滋生。因此，研究这些霉菌的分布及其毒素产生能力，对于制定有效的防控措施至关重要。

为了满足快速检测的需求，科学家们开发了一种名为环介导等温扩增（LAMP）的分子技术。LAMP技术以其简单、快速、高灵敏度和高特异性而著称，其核心原理是通过特定的引物设计，在恒定温度下进行DNA扩增，从而实现对目标微生物的高效识别。与传统的PCR技术相比，LAMP不需要复杂的温度循环设备，因此特别适用于现场快速检测或资源有限的环境。

本研究的目标是分离并鉴定意大利地区 pistachio 样本中与黄曲霉毒素相关的霉菌种类，并基于其毒素合成途径中关键基因设计一种LAMP检测方法。通过这种方法，可以快速、准确地识别出具有毒素生产能力的霉菌，从而为食品安全控制提供科学依据。研究还强调了引物稳定性的优化，以确保LAMP方法在长期储存和实际应用中的可靠性。

为了提高LAMP方法的实用性，研究团队采用了一种新的引物制备方式，即通过空气干燥的方式保存引物，避免了传统液态引物在储存过程中可能受到污染或降解的问题。干燥后的引物在35°C环境下仍能保持稳定性长达45天，这大大提升了其在实际操作中的便利性。同时，这种方法还降低了对专业设备和复杂操作流程的依赖，使得LAMP检测可以在更多场景中被应用，包括食品加工现场、运输途中或资源有限的地区。

在实验过程中，研究人员首先对意大利的pistachio样本进行了采集和霉菌分离。他们发现，*A. flavus*是主要的霉菌种类，其发生率高达93.13%，而*A. parasiticus*也较为常见。值得注意的是，所有分离出的*A. flavus*和*A. parasiticus*菌株均表现出黄曲霉毒素B1（AFB1）的生产能力，其中*A. flavus* PGA95菌株的AFB1产量高达10107.8 ng/mL，而*A. parasiticus* PGA72菌株的AFB1产量为1448.2 ng/mL。这些数据表明，这些霉菌在意大利pistachio中具有较高的毒素生产能力，因此，对其进行有效监测具有重要意义。

基于上述发现，研究人员设计了一种针对*Nor1*基因的LAMP检测方法。*Nor1*基因是黄曲霉毒素合成过程中的关键基因之一，其表达与毒素生成密切相关。通过LAMP技术，研究人员能够以极低的DNA量（0.03 pg/反应）实现对这两种霉菌的准确识别，这使得该方法在实际应用中具备极高的灵敏度。此外，LAMP技术的特异性也得到了验证，能够有效区分目标霉菌与其他非目标菌种，确保检测结果的可靠性。

为了进一步验证该LAMP方法的有效性，研究人员在不同来源的pistachio样本中进行了测试。这些样本包括从市场、储存设施以及田间采集的样本，覆盖了广泛的环境条件。实验结果表明，该方法能够直接检测受污染的pistachio样本，其最低检测水平为0.5个孢子/g。这一灵敏度使得LAMP方法能够有效识别出低浓度的霉菌污染，为食品质量控制提供了强有力的支持。

研究还通过实际测试，确认了该LAMP方法在不同环境条件下的稳定性。引物经过空气干燥后，即使在较高的温度下（如35°C），仍能保持其性能，且在45天的储存期内未出现显著的性能下降。这表明，干燥后的引物不仅在实验室环境中具有优势，在实际应用中也能够提供可靠的检测结果。这种稳定性对于需要长时间运输或在缺乏冷藏条件的地区尤为重要，因为它减少了对额外储存条件的需求，从而提高了检测方法的适用性和便捷性。

此外，研究人员还通过模拟实验测试了LAMP方法在不同样本中的适用性。实验中，研究人员对pistachio样本进行了表面灭菌处理，并人工接种了*A. flavus*和*A. parasiticus*的孢子悬浮液。通过这种方式，他们能够控制霉菌的污染水平，并评估LAMP方法在不同浓度下的检测能力。结果显示，该方法能够有效检测出各种浓度的霉菌，无论是低浓度还是高浓度的样本，都能得到准确的结果。这种检测能力对于食品安全监管具有重要的意义，因为它能够帮助相关部门在早期阶段发现潜在的污染风险，从而采取相应的防控措施。

为了确保LAMP方法的准确性，研究人员还进行了大量的特异性测试。他们使用了多种非目标菌种，如*A. niger*、*A. tubingensis*、*A. tamarii*和*Penicillium digitatum*等，这些菌种通常不产生黄曲霉毒素。通过与这些非目标菌种的对比，研究人员确认了LAMP方法的特异性，即它仅能检测出*A. flavus*和*A. parasiticus*，而不会误判其他菌种。这种特异性对于食品安全检测至关重要，因为它可以避免误报和漏报，从而确保检测结果的科学性和实用性。

综上所述，本研究不仅揭示了意大利pistachio中主要的黄曲霉毒素产生菌种，还开发了一种高效、灵敏且稳定的LAMP检测方法。该方法能够直接检测受污染的食品样本，适用于多种环境条件，并且无需复杂的设备支持，这为食品安全检测提供了新的解决方案。通过这种方式，可以更有效地监控黄曲霉毒素的污染情况，从而保障消费者的健康和食品安全。