冷冻保存细胞与组织样本的微尺度细胞表面蛋白质组学新方法

《Molecular & Cellular Proteomics》：Microscaled Cell Surface Proteomics for Cryo-preserved Cells and Tissue Samples

本研究针对冷冻保存和低输入量临床样本表面蛋白质组分析的技术瓶颈，开发并系统比较了N-糖肽富集(NGE)和WGA-HRP邻近标记两种互补策略。研究证实两种方法在低至105个细胞输入量下仍能稳定鉴定700余种表面蛋白，并在冷冻样本中保持高重现性(Pearson相关系数>0.9)，为临床样本生物标志物发现提供了可靠技术平台。

　　

细胞表面蛋白质（CSPs）作为细胞与外界环境交流的"分子天线"，在细胞信号转导、免疫识别和细胞间通讯中发挥着至关重要的作用。这些膜蛋白不仅是疾病诊断的重要生物标志物，更是超过60%临床药物的作用靶点。然而，对临床来源的样本（如患者活检组织）进行精准的表面蛋白质组分析却面临巨大挑战——这些样本通常经过冷冻保存处理，且可获得细胞数量极其有限，传统蛋白质组学方法难以应对。

目前表面蛋白质组学领域存在两大技术路线：一类是基于糖基化标记的策略，如N-糖肽富集法（N-glycopeptide Enrichment, NGE），通过特异性标记细胞表面的糖蛋白来实现富集；另一类是基于邻近标记的策略，如麦胚凝集素-辣根过氧化物酶（WGA-HRP）标记法，利用酶促反应在细胞表面蛋白质周围进行生物素标记。尽管这些方法在新鲜培养细胞中表现良好，但它们在实际临床样本中的应用效果如何？哪种方法更适合处理冷冻保存的低输入量样本？这些问题尚未有系统性的答案。

为了解开这些谜团，由John R. Thorup和Shankha Satpathy领衔的研究团队在《Molecular & Cellular Proteomics》上发表了重要研究成果。他们首次对这两种主流表面蛋白质组学方法进行了头对头的系统比较，并成功将其应用于冷冻保存的细胞系和实体组织样本，为临床样本的表面蛋白质组学研究建立了可靠的技术标准。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先，他们优化了适用于低输入量（少于100万个细胞）的NGE和WGA-HRP表面蛋白标记与富集流程；其次，利用肺癌细胞系A549和骨髓瘤细胞系KMS-12-BM，系统评估了两种方法在新鲜与冷冻保存条件下的性能；此外，他们还建立了子宫内膜组织的优化解离方案，并对三名健康供体的冷冻保存子宫内膜样本进行了表面蛋白质组分析；最后，通过EGF刺激实验验证了方法检测表面蛋白动态变化的能力，所有质谱数据采用DIA（数据非依赖采集）模式在Orbitrap Exploris 480仪器上采集，并使用Spectronaut软件进行分析。

比较细胞系富集策略及输入量的影响

研究人员首先在HEK293T细胞中进行了输入量滴定实验，比较了NGE和WGA-HRP两种方法在10⁵到5×10⁶个细胞范围内的表现。结果显示，在最低输入量（10⁵个细胞）下，两种方法均能鉴定约200个表面蛋白，最高可达500个左右。值得注意的是，NGE方法在中等输入量下表现出更高的特异性，而WGA-HRP则能捕获互补的表面蛋白亚群。两种方法联合使用共鉴定出700多个表面蛋白，其中约175个为各自独有的鉴定结果。

深入分析发现，NGE方法独特鉴定的蛋白主要富集在细胞粘附功能相关通路，而WGA-HRP独特鉴定的蛋白则与离子转运功能相关。这种差异与两种方法的工作原理密切相关：NGE依赖于蛋白质表面的N-连接糖基化位点，而许多细胞粘附分子具有丰富的糖基化修饰；相反，WGA-HRP能够标记缺乏糖基化修饰的表面蛋白，如某些离子通道蛋白。

应用于冷冻保存的悬浮和贴壁细胞系

研究团队进一步在血液癌细胞系KMS-12-BM和肺癌细胞系A549上验证了方法的稳健性。结果显示，无论是悬浮细胞还是贴壁细胞，新鲜样本与冷冻保存样本之间的表面蛋白质组高度一致，Pearson相关系数均超过0.9。对于贴壁细胞，研究还比较了不同解离方法（刮取法、versene处理、TrypLE酶解）对表面蛋白完整性的影响，发现温和的物理刮取法和versene处理能更好地保留表面蛋白，减少酶解导致的蛋白"削切"效应。

利用表面蛋白质组学监测细胞系中动态CSP变化

为了验证方法检测生物学动态变化的能力，研究人员用表皮生长因子（EGF）刺激A549细胞，模拟EGFR受体的内吞和降解过程。NGE方法成功捕捉到EGFR在细胞表面的快速减少（10分钟内）以及后续的溶酶体降解过程（3小时后）。特别有趣的是，当使用氯喹抑制溶酶体功能时，虽然总EGFR蛋白水平因降解受阻而上升，但表面EGFR却进一步减少，提示受体内吞过程仍在进行，但回收途径受阻。这一发现揭示了表面蛋白质组学在解析复杂膜蛋白 trafficking 动态中的独特价值。

相比之下，全局蛋白质组分析仅能检测到EGFR总量的变化，而无法区分表面与胞内池的差异。这凸显了表面特异性富集方法在研究膜蛋白动态调控中的不可替代性。

实体组织冷冻保存单细胞悬液的表面蛋白质组分析

最后，研究团队将优化后的方法应用于临床相关的子宫内膜组织样本。他们比较了三种组织解离方案：20分钟TrypLE酶解（T-20）、60分钟TrypLE酶解（T-60）和gentleMACS机械解离法（GM）。结果表明，T-20方案在保持细胞活性和表面蛋白完整性方面表现最佳，即使输入量低至50万个细胞，仍能稳定鉴定超过400个表面蛋白。

对三名健康供体的子宫内膜样本分析显示，表面蛋白质组谱能清晰区分不同个体，证明了方法在捕捉生物个体差异方面的敏感性。这一发现为未来利用表面蛋白质组进行患者分型和生物标志物发现奠定了坚实基础。

研究结论与意义

这项研究系统评估了两种表面蛋白质组学策略在低输入量和冷冻保存样本中的性能，建立了适用于临床转化研究的标准化工作流程。研究表明，NGE方法在低输入量条件下具有更高的特异性和定量准确性，特别适合处理细胞数量有限的临床样本；而WGA-HRP方法则能提供互补的表面蛋白覆盖，尤其适用于检测低糖基化修饰的膜蛋白。

该工作的创新性在于首次提供了不同表面蛋白质组学方法的直接比较数据，并证实了这些方法在真实世界临床样本中的适用性。这不仅为研究人员根据具体实验需求选择合适方法提供了实用指导，更重要的是为利用珍贵临床样本进行表面蛋白质组学研究打开了新途径。随着精准医疗时代的到来，这种能够应对临床样本复杂性的技术平台将在疾病机制研究、生物标志物发现和药物靶点鉴定中发挥越来越重要的作用。

未来，随着表面蛋白质组学技术的不断优化和自动化程度的提高，我们有望在更微量的临床样本中实现更深入的表面蛋白覆盖，从而在单细胞水平上解析细胞表面分子的异质性，为理解疾病发生发展和治疗反应提供前所未有的分子洞察。