高通量评估体外CRISPR活性有助于优化大规模多重富集稀有变异的过程

《Nature Biomedical Engineering》：High-throughput evaluation of in vitro CRISPR activities enables optimized large-scale multiplex enrichment of rare variants

CRISPR-Cas9切割效率高通量评估方法及生物医学应用研究。开发Cut-seq1/2检测数万至数十万对sgRNA-靶序列切割效率，发现与插入-缺失频率相关性低但PAM兼容性高度一致。构建DeepCut深度学习模型优化sgRNA设计，建立CLOVE-seq方法实现多组学稀有变异富集检测。

　　

摘要

以往对大量目标RNA序列和引导RNA序列的CRISPR活性进行的高通量评估主要是通过测量插入-删除频率来进行的，而非切割效率。在此，我们开发了两种高通量的体外方法（Cut-seq1和Cut-seq2），用于评估数万甚至数十万对引导RNA-目标RNA之间的Cas9切割效率。研究结果表明，体外切割效率与细胞内的插入-删除频率之间存在较低的相关性，但在引导RNA的特定结构（如protospacer区域）的兼容性方面却具有高度一致性。利用这些体外切割效率的数据集，我们构建了一套深度学习模型（DeepCut），能够识别出能够选择性切割特定序列的优化型单引导RNA，即使在存在相似干扰序列的情况下也能实现这一目标。基于这些优化后的单引导RNA，我们进一步开发了CLOVE-seq方法（全称为“大规模优化变异富集测序”），通过Cas9对干扰序列或稀有变异序列进行特异性切割，从而实现多种样本中稀有变异的富集。我们的方法有助于更深入地理解CRISPR核酸酶的活性，并可用于在各种生物医学领域检测大量稀有变异。