经典Wnt信号通路激活提升人源诱导肝祖细胞直接重编程效率

《Stem Cell Reports》：Activation of canonical Wnt signaling is required for efficient direct reprogramming into human hepatic progenitor cells

本研究针对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）直接重编程为诱导肝祖细胞（hiHepPCs）效率低下的瓶颈问题，通过小分子化合物筛选发现经典Wnt信号通路激活剂CHIR99021可显著提升重编程效率。研究证实Wnt激活通过快速诱导染色质重塑和基因表达变化促进细胞命运转化，并发现内源性WNT2B是启动重编程的关键因子。该成果为肝病细胞治疗提供了高效稳定的细胞来源技术方案。

　　

在再生医学领域，如何获得足够数量且功能稳定的细胞来源一直是重大挑战。虽然诱导多能干细胞（iPSC）技术为细胞治疗带来了希望，但其过程复杂、耗时较长且存在成瘤风险。直接重编程技术通过特定转录因子将体细胞直接转化为目标细胞类型，避免了多能阶段，为疾病建模和细胞治疗提供了新思路。日本九州大学研究团队此前发现FOXA3、HNF1A和HNF6三种转录因子组合可将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）重编程为诱导肝祖细胞（hiHepPCs），这些细胞具有长期自我更新能力，并能分化为功能性的肝细胞和胆管细胞，在急性肝衰竭小鼠模型中展现出显著的治疗效果。然而，重编程效率低下严重限制了其实际应用。

为突破这一技术瓶颈，研究团队开展了系统性研究。他们首先通过小分子化合物筛选平台，测试了10种已知影响细胞重编程的化合物，包括MEK抑制剂、GSK-3抑制剂等。研究发现，两种GSK-3抑制剂CHIR99021和BIO（均为经典Wnt信号通路激活剂）能显著提高ALB⁺ hiHepPCs的形成效率，其中CHIR99021效果尤为突出。

在技术方法层面，研究主要运用了：1）逆转录病毒介导的转录因子转导系统；2）免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型鉴定；3）3'UTR测序（3'UTR-seq）分析转录组变化；4）ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）检测染色质开放性；5）CRISPR干扰（CRISPRi）技术进行基因功能研究；6）三维培养系统评估细胞分化潜能。

Activators of the canonical Wnt signaling pathway increase reprogramming efficiency of HUVECs to hiHepPCs

研究人员通过免疫荧光染色发现，在重编程过程中添加CHIR99021可显著增加ALB⁺细胞集落数量，且这种促进作用具有特异性，其他测试化合物均未表现出类似效果。流式细胞术分析进一步证实CHIR99021处理组中表达上皮细胞标志物E-cadherin的hiHepPCs比例显著升高。

Gene expression changes and chromatin remodeling in the reprogramming of HUVECs to hiHepPCs proceeds more rapidly in culture with CHIR99021

通过3'UTR-seq和ATAC-seq分析，研究团队发现CHIR99021能加速重编程过程中的表观遗传学改变。在转录水平，肝功能相关基因（如代谢过程相关基因）快速上调，而HUVEC特征基因迅速下调。在染色质水平，ALB基因调控区域在CHIR99021存在下更早出现开放性增加。

CHIR99021 induces rapid chromatin remodeling in the reprogramming of HUVECs to hiHepPCs

ATAC-seq数据分析显示，CHIR99021处理导致差异可及区域（DARs）数量显著增加，其中获得开放性的区域（DAR(gain)）富含物质运输、胆汁酸分泌和代谢过程相关基因，而关闭区域（DAR(lose)）则与HUVEC功能相关。这表明Wnt激活通过快速重构染色质景观促进细胞身份转换。

Wnt activation is effective in the early stages of direct reprogramming from HUVECs to hiHepPCs

时间梯度实验表明，CHIR99021在重编程早期（感染后至少4天）添加即可显著提高效率，延长处理时间并无额外增益。相反，使用Wnt产生抑制剂IWP2处理发现，抑制内源性Wnt激活会严重阻碍hiHepPCs形成，处理超过4天几乎完全阻断重编程进程。

Activation of the endogenous Wnt signaling pathway in the early stages of hiHepPC induction

转录组分析显示，重编程早期Wnt信号通路相关基因显著富集，其中80%以上属于经典Wnt通路。特别值得注意的是，在HUVECs中表达的WNT基因家族成员中，仅WNT2B在重编程诱导后表达水平上升。

WNT2B secreted from transduced HUVECs is critical for the induction of hiHepPCs

通过CRISPRi技术特异性抑制WNT2B表达，研究人员发现ALB表达水平显著降低，hiHepPCs形成数量明显减少，而其他经典Wnt配体基因表达未受影响。这证明内源性WNT2B是启动直接重编程的必要条件。

本研究系统阐明了经典Wnt信号通路在体细胞直接重编程中的关键作用。研究发现不仅外源性Wnt激活能显著提高重编程效率，内源性WNT2B介导的自分泌信号更是启动细胞命运转换的必要条件。Wnt激活通过快速诱导染色质重塑和基因表达重编程，促进HUVECs向hiHepPCs的高效转化。这一发现不仅深化了对细胞命运决定机制的理解，更重要的是为肝病细胞治疗提供了可快速获得大量功能细胞的技术路径。相比传统方法，CHIR99021辅助的重编程策略能在更短时间内产生更大量的hiHepPCs，为其在药物筛选、疾病建模和临床治疗中的应用奠定了坚实基础。该研究成果发表于《Stem Cell Reports》期刊，为再生医学领域提供了重要的技术突破和理论支撑。