新型三明治杂交检测技术及探针组在蓝藻水华早期诊断中的突破性应用

《Analytical Biochemistry》：A novel sandwich hybridization assay method and probe sets for cyanobacterial harmful algal bloom detection

本文针对日益严重的蓝藻有害藻华（cHABs）快速检测难题，开发了一种基于16S核糖体RNA（rRNA）的新型三明治杂交检测（SHA）方法及特异性探针组。该技术通过手动操作96孔板实现了对Planktothrix、Raphidiopsis及Anabaena-Dolichospermum-Aphanizomenon（ADA）支系的高通量检测，灵敏度达10–500 mm3·L?1，为水体管理与公共卫生风险预警提供了高效工具。

　　

随着全球气候变化和富营养化加剧，蓝藻有害藻华（Cyanobacterial Harmful Algal Blooms, cHABs）已成为威胁淡水资源安全的突出问题。这些藻华不仅消耗水体溶解氧导致水生生物死亡，更危险的是某些蓝藻种类能够产生多种藻毒素（如微囊藻毒素、柱孢藻毒素等），直接危害人类健康。历史上，此类毒素曾引发多起重大公共安全事件，例如2014年美国托莱多市饮用水危机导致40万人断水，以及巴西透析中心因毒素污染导致的集体肝衰竭事件。传统监测方法如显微镜计数、定量PCR等技术虽有一定效果，但存在耗时长、操作复杂或无法实时反映藻群动态变化等局限。因此，开发一种快速、高通量且能特异性识别常见产毒蓝藻属的检测技术，对水质管理和疾病预防具有紧迫意义。

在此背景下，发表于《Analytical Biochemistry》的研究论文《A novel sandwich hybridization assay method and probe sets for cyanobacterial harmful algal bloom detection》提出了一种创新解决方案。该研究通过优化三明治杂交检测（Sandwich Hybridization Assay, SHA）方法，设计了针对Planktothrix、Raphidiopsis和Anabaena-Dolichospermum-Aphanizomenon（ADA）支系的特异性寡核苷酸探针，实现了在2.5小时内对21个样本同步检测的高通量筛查能力。

研究团队主要采用探针设计优化、96孔板手动操作SHA流程、标准曲线定量分析及环境样本验证等关键技术方法。其中，探针基于SILVA 16S rRNA数据库（v138）通过ARB软件设计，并利用荧光原位杂交（FISH）和BLAST验证特异性；环境样本来自俄亥俄州三大水体（桑达斯基湾、大圣玛丽湖、斯普林布鲁克湖），通过显微镜生物量计数与SHA结果对比完成验证。

特异性SHA探针组的开发与验证

通过分析16S rRNA基因序列，研究团队设计了三条新型捕获探针（CYL186、PLX594、ADA724），分别靶向Raphidiopsis、Planktothrix和ADA支系，并搭配通用细菌信号探针（EUB338）和蓝藻特异性探针（CYA762）。实验显示，探针组能准确区分目标蓝藻与非目标菌株（如Microcystis），仅Planktothrix agardhii 1030因rRNA序列单碱基突变（C-A转位）与CYL186探针出现微弱交叉反应，但通过提高杂交温度至30°C可显著抑制干扰。

标准曲线与检测限分析

以产毒模式菌株（如产柱孢藻毒素的R. raciborskii CS-506）构建标准曲线，结果显示PLX594与CYL186探针的定量范围为10–500 mm³·L^?1，ADA724为50–500 mm³·L^?1。检测下限（LLOD）最低可达5 mm³·L^?1（PLX594），灵敏度满足新西兰环境署对藻华预警阈值（0.5 mm³·L^?1）的要求。

环境样本检测效能验证

在俄亥俄州三类典型水体中，SHA成功检出目标属，且结果与显微镜计数高度一致。例如，桑达斯基湾样本中ADA支系生物量为41.79 mm³·L^?1，SHA呈阳性；大圣玛丽湖以Planktothrix为主（生物量168.30 mm³·L^?1），但SHA同时检出低丰度ADA与Raphidiopsis（1.06–3.34 mm³·L^?1），证实该方法对混合藻群的识别能力。

研究结论与意义

本研究首次将手动操作SHA技术应用于淡水蓝藻多属同步检测，突破了传统机器人操作对通量的限制，单次可检测样本量提升至66个。该方法操作简便、成本可控（试剂费用相当于5次ELISA检测），易于在水厂或监测机构推广。未来若结合环境样本处理器（Environmental Sample Processor, ESP）及标准化试剂，有望实现藻华动态的实时原位监控，为多毒素风险预警提供关键数据支撑。该技术不仅填补了非Microcystis蓝藻检测的技术空白，更为全球水安全管理提供了高效、可靠的分子工具。