综述：中红外光谱学及其在生物医学分析与成像中的应用

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Mid-infrared Spectroscopy and Its Applications in Biomedical Analysis and Imaging

本综述系统阐述了中红外（MIR）光谱与成像技术（如傅里叶变换红外（FTIR）光谱和中红外光热（MIP）显微镜）的原理、优势、局限性与最新进展。重点探讨了这些非破坏性、高灵敏度技术在生物分子（蛋白质、脂质、核酸）结构分析、癌症（如乳腺癌）早期诊断、细胞代谢研究、骨关节炎（OA）软骨成分检测以及生物体液（血清、唾液）光谱指纹识别等生物医学领域的广泛应用，展望了其与机器学习等前沿技术融合的未来发展方向。

　　

引言

自20世纪中叶以来，结合了显微镜的红外（IR）光谱技术，通常称为红外显微光谱学，已成为一种非破坏性、无标记的分析技术，以其高灵敏度和特异性著称。傅里叶变换红外（FTIR）光谱学是该领域的基石，已广泛应用于生物学、化学、材料科学及其他交叉学科领域。近年来，中红外光热（MIP）显微镜——一种使用中红外光作为激发源、可见光作为检测源的技术——发展成为一种远场超分辨率红外光谱和成像技术。MIP显微镜将红外光谱和成像的空间分辨率提高到300–600纳米，从而弥合了传统远场红外显微镜（受衍射限制）和近场红外光谱/成像技术之间的差距。

傅里叶变换红外（FTIR）光谱学

原理与发展

FTIR显微镜将FTIR光谱学与传统光学显微镜相结合，作为微观样品FTIR检测的工具。中红外（MIR）光谱在2.5–20μm波长（对应波数4000–500 cm^-1）范围内是分子振动的直接探针。化合物的红外吸收光谱能够特异性识别化学物质。通过合并显微镜和光谱学，FTIR显微镜绘制不同光谱带的吸光度变化图。

红外光谱反映了分子振动。MIR吸收光谱绘制了从4000到500 cm^-1的吸收强度对波数的图，对应于从基态（E₀）到第一激发态（E₁）的振动能级跃迁。当样品放置在红外光源和检测器之间的光路中时，振动频率与红外光束频率匹配的分子会吸收光，促进从振动基态到激发态的跃迁。

FTIR光谱仪的发展历程漫长。20世纪70年代，FTIR光谱仪首次亮相。80年代，FTIR光谱仪与红外显微镜的成功集成使得进行FTIR显微光谱学（micro-FTIR）成为可能。随着计算机、电子学、化学计量学算法等相关领域的发展，成像设备的开发取得了实质性进展。90年代中后期，MIR阵列探测器的商业应用促进了FTIR成像光谱仪的发展。

优势与局限

FTIR光谱仪在生物物理研究中表现出若干优势，特别是采样要求低，仅需少量材料，无需探针分子，并能提供丰富的物理信息。然而，传统应用中的红外光谱（包括FTIR）要求待测样品均质化，这极大地限制了红外光谱在生物组织研究中的应用。此外，传统样品制备方法需要相对较大的样品量，测量光谱是整个采样区域的平均光谱。

Micro-FTIR光谱学使得测量异质材料成为可能。它提供了在秒到分钟的时间尺度上在单细胞水平获得与分子组成和结构相关的生化信息的可能性。然而，样品厚度、基底材料以及细胞和组织样品中生化成分的固有均匀性等因素都会影响吸收光谱。

尽管配备了焦平面阵列（FPA）探测器，FTIR显微镜的数据采集和处理速度大大提高，但对于来自大型组织微阵列（TMA）的大面积组织（cm²），通常需要几个小时才能获得完整数据。此外，这些快速增长的数据集的存储和分析也面临重大挑战。

红外光谱在实际应用中仍面临一些局限。首先，由于样品的各向异性，难以在生物样品中实现精确的吸收测量。生物样品中与波长相关的光散射可能导致显著的基线伪影。其次，红外成像的空间分辨率相对较低，通常在3至30μm。第三，在透射模式下进行的红外成像缺乏深度分辨能力。此外，水在红外光谱区域的强吸收性阻碍了其在水环境中活体系统功能分析的应用。虽然衰减全反射（ATR）模式的使用部分克服了水吸收问题，但ATR-FTIR在生物医学中常规使用的最显著缺点仍然是溶液相红外光谱中固有的宽带宽和多重重叠的光谱带轮廓。

生物医学应用

癌症诊断

FTIR光谱学对于癌症筛查和早期诊断具有无可估量的价值，因为红外光谱的变化先于细胞病理形态学的改变——这比依赖可见结构变化的传统组织病理学技术更具优势。其肿瘤光谱分析方法具有准确性高、速度快和假阴性率低的特点。

以乳腺癌为例，FTIR成像数据主要通过三种互补的方法区分肿瘤区域和健康组织的分子信息：（i）通过血管脂质和蛋白质的光谱特征绘制肿瘤和健康血管分布图；（ii）量化代谢性缺血引起的失衡（例如，糖原减少、脂质氧化改变）；（iii）评估氧化应激对磷脂脂肪酸酰基链的影响（反映在C-H伸缩带的位移上）。研究表明，恶性组织显示出相对核酸含量增加（与细胞增殖增加一致）、胶原蛋白水平降低（反映细胞外基质降解）以及磷酸化蛋白质的灵活性和结构有序性降低。

FTIR光谱学不仅限于癌症检测，还可应用于其他疾病的检测，如结肠炎、组织纤维化和骨病。

细胞研究

FTIR光谱学可用于识别组织中的细胞类型。例如，研究已成功区分了人乳腺癌细胞系MCF-7（表达雌激素受体，ER+）和SKBr3（不表达雌激素受体，ER-）。此外，FTIR光谱学还可应用于脱落宫颈和口腔细胞的筛查，以及研究活细胞的物质代谢、药物与细胞的相互作用和细胞生物分子。

骨关节炎研究

在关节软骨和骨关节炎（OA）的研究中，FTIR成像技术可以同时收集样品的分子光谱和表面形貌信息，获取样品空间每个微区位置的组成和分子结构信息。这使得它可以应用于研究与OA相关的关节软骨主要成分（胶原蛋白和蛋白聚糖）的含量分布以及胶原纤维的结构取向，从而促进早期诊断。研究利用FTIR成像偏振技术测量了人类关节炎组织切片中的胶原分子，发现该技术能更有效地测量人类OA关节软骨分子排列的变化。

生物体液分析

生物体液（如血液、血清、唾液、尿液等）是诊断分析的理想候选者。通过使用FTIR光谱学，可以获得生物体液的光谱指纹，从而可以使用计算方法对不同类别的光谱进行分类，并可能识别生物标志物。例如，对血浆/血清进行生化分析可以实现实体瘤的快速检测和类别预测、分子亚型的快速低成本鉴定以及肿瘤状态的快速评估。

中红外光热（MIP）显微镜

原理与技术

光热光谱学是一类以光热转换过程为特征的光谱现象。MIP显微镜技术，也称为光学光热红外显微镜（O-PTIR microscopy）技术或红外光热外差成像（IRPHI）技术，是一种远场超分辨率红外光谱和成像技术。

在MIP显微镜中，使用可见光束检测由强度调制的红外光束产生的热效应（热效应包括热膨胀、压力波发射、折射率改变和Grüneisen参数变化）。根据可见光区域检测波长的衍射极限，光谱和成像的空间分辨率可以提高到300-600纳米。

MIP信号源于吸收体在红外光子激发后发生的非辐射弛豫过程。所有光热检测机制都源于样品光学物理性质的变化对探测光束造成的扰动。MIP的检测也可以通过光声（PA）信号来实现。

优势

光热光谱学提供了一种超灵敏的测量吸光度的方法。使用固定波长的可见光作为探测光束有几个优点：首先，它提高了阿贝衍射分辨率，增强了传统MIR成像的空间分辨率；其次，它消除了红外光束波长依赖性散射引起的伪影；第三，所使用的可见光探测器基于成熟技术，可靠、灵敏且成本效益高；第四，检测所需的功率低于样品损伤阈值；最后，水对探测光束的吸收可以忽略不计。

MIP显微镜克服了FTIR分辨率低和难以应用于液体样品的局限性。此外，MIP可以通过泵浦-探测机制的非线性信号提供三维（3D）切片能力，这是线性吸收红外成像无法实现的。

生物医学应用

病毒检测

MIP成像能够实现病毒的无接触、易操作、高灵敏度检测。研究人员利用背向传播共焦干涉MIP显微镜首次记录了单个病毒（如牛痘病毒和水泡性口炎病毒（VSV））的振动指纹光谱。通过识别胸腺嘧啶和尿嘧啶残基振动的不同核酸信号，可以区分DNA和RNA病毒。

细菌研究

MIP技术能够在单细菌水平进行深入研究。它可以在指纹区和高波数光谱范围内实现细胞尺度的细菌代谢成像。例如，研究首次使用MIP显微镜在单细胞水平监测了大肠杆菌对标记化合物的摄取。MIP还可以与其他技术集成，如结合拉曼显微光谱学，在几秒钟内从脂肪细胞或单个细菌中获取光热IR和拉曼指纹光谱。

细胞器与亚细胞动力学

对于哺乳动物细胞中复杂的细胞器，MIP显微镜已展示了对活细胞中特定组分的高性能化学成像能力。脂滴和蛋白质参与了各种生物过程，并且由于其内部基团的强信号，它们是MIP成像的绝佳目标。研究实现了对活细胞和生物（如秀丽隐杆线虫）中内源性脂质和外源性药物分布的可视化，并首次展示了空间分辨率为0.6μm的活细胞和生物体的3D键选择性成像。

MIP在揭示亚细胞时空动力学方面潜力巨大。例如，实时成像少突胶质细胞揭示了细胞分裂、凋亡和迁移的细节。同时，还观察到了神经元中囊泡通过细胞骨架从细胞体到树突分支的运输。MIP技术进一步为蛋白质折叠和聚集的研究提供了一个新颖而强大的工具。

组织成像

人们对样本固有特征的数字光谱组织病理学的兴趣日益增长和广泛。例如，利用宽场干涉测量结合机器学习测量未染色的乳腺组织微阵列玻片的全玻片红外吸收图像，从而生成用于自动组织病理学分割和计算染色图像的算法。此外，MIP成像已成功用于心肌组织的化学成像，可视化不同生物分子（包括蛋白质、含磷蛋白质和脂质/碳水化合物/氨基酸）的分布。

结论

与现有的筛查、诊断、管理和监测方法相比，FTIR光谱学以其简单、快速、高精度、成本效益高、非破坏性和兼容自动化而脱颖而出。通过识别患者分子水平的生化改变，FTIR光谱学有潜力改变临床决策过程并改善患者预后。然而，其在疾病诊断中的应用仍面临标准化、数据处理和临床转化等挑战。与此同时，MIP显微镜作为一种新兴的强大工具，以其亚微米空间分辨率、键选择性和对液体样品的兼容性，为在更接近生理条件下研究生物系统开辟了新途径，有望在生命科学和临床医学中发挥越来越重要的作用。