基于金字塔探针的频率依赖性细胞微观流变学原子力显微镜技术研究

《Biophysical Journal》：Frequency-dependent cellular microrheology with pyramidal atomic force microscopy probes

为解决传统球形探针成本高、制备难的问题，研究人员开展基于标准钝头金字塔AFM探针的振荡流变学研究，建立可直接使用商业化探针的微观流变学框架，成功应用于细胞骨架抑制剂处理的细胞力学测量，为活细胞动态力学表征提供新方案。

　　

在生物力学研究领域，活细胞的机械特性测量一直是科学家们关注的焦点。原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）作为纳米级力学表征的重要工具，长期以来被广泛应用于细胞弹性模量的测量。传统方法主要通过分析固定加载速率下的力-压痕曲线来提取杨氏模量（Young's modulus）。然而，细胞作为复杂的生命体系，具有显著的时间依赖性力学响应特性——它们能够随时间推移松弛外界施加的应力，并表现出明显的频率依赖性损耗特性。这种动态力学行为在细胞迁移、分化和信号传导等关键生物学过程中都扮演着重要角色。

尽管AFM振荡流变学技术能够通过微米级频率扫描捕捉这些动态力学特性——让AFM探针以振荡方式在不同频率下压入样品，同时记录样品的振荡响应，然后利用动态应力与应变的关系提取频率依赖性微观流变学参数——但这一强大技术却始终未能得到充分应用。究其原因，主要在于传统方法要求使用球形探针，这类探针虽然能产生相对较低的压痕压力，但往往价格昂贵且制备困难。因此，开发能够直接使用标准钝头金字塔AFM探针进行振荡流变学研究的框架显得尤为重要。

在《Biophysical Journal》发表的最新研究中，Erika A. Ding和Sanjay Kumar团队针对这一技术瓶颈开展了创新性研究。他们建立了一套完整的实验和理论框架，使标准的钝头金字塔AFM探针能够"即买即用"地进行振荡流变学测量。研究人员不仅推导了从实验数据中提取流变学模量的数学表达式，还深入探讨了校准和参数优化等实际实验问题，并通过琼脂糖水凝胶标准品对方法进行了验证。更重要的是，他们将该技术应用于经细胞骨架抑制剂处理的培养细胞力学测量，获得了与预期细胞骨架网络贡献相符的流变学变化结果。

关键技术方法包括：原子力显微镜（AFM）振荡流变学技术、金字塔探针校准方法、频率扫描实验方案、基于动态应力-应变关系的流变学模量提取算法，以及以琼脂糖水凝胶作为力学标准品的验证体系。细胞实验采用培养细胞模型，通过细胞骨架抑制剂诺考达唑（nocodazole）和细胞松弛素D（cytochalasin D）进行干预。

理论框架建立

研究人员首先建立了基于金字塔探针的振荡流变学理论框架，推导出从实验数据提取储能模量（storage modulus）和损耗模量（loss modulus）的数学表达式。该框架充分考虑了金字塔探针的几何特性与传统球形探针的区别，为标准化数据分析奠定了基础。

方法验证

研究团队使用琼脂糖水凝胶标准品对建立的方法进行系统验证。通过比较传统球形探针与金字塔探针的测量结果，证实金字塔探针在宽频率范围内能够获得可靠、一致的流变学数据，验证了新方法的准确性和可靠性。

实验参数优化

针对金字塔探针在振荡流变学中的应用，研究人员详细探讨了实验参数优化的策略，包括振荡幅度、频率范围和压入深度等关键参数的确定原则，为方法的标准化和可重复性提供了实践指导。

细胞力学应用

在细胞实验中，研究团队分别使用微管破坏剂诺考达唑和肌动蛋白抑制剂细胞松弛素D处理培养细胞，观察细胞骨架成分对频率依赖性力学响应的贡献。结果显示，不同细胞骨架网络确实对应特定的流变学特征变化，证明了该方法在解析复杂细胞力学特性方面的灵敏度。

研究结论表明，基于标准钝头金字塔AFM探针的振荡流变学框架不仅解决了传统球形探针成本高、制备难的问题，更重要的是为活细胞动态力学表征提供了更加便捷、可靠的技术方案。该方法能够有效捕捉细胞在不同频率下的粘弹性响应，为理解细胞骨架各组分在力学行为中的具体贡献提供了新的技术手段。这项研究的成功开展，不仅推动了AFM振荡流变学技术的普及应用，也为细胞生物力学研究领域提供了重要的方法学创新，预计将在药物筛选、疾病机理研究等领域产生广泛影响。