EPICYCLE研究：采用临床级标准开展多中心确证性临床前研究评估BRD4与CDK9抑制剂抗横纹肌肉瘤疗效

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：EPICYCLE: A confirmatory preclinical study of the anti-rhabdomyosarcoma efficacy of BET bromodomain and cyclin-dependent kinase 9 inhibitors

本研究针对PAX3::FOXO1阳性横纹肌肉瘤治疗难题，创新性地采用多中心随机双盲设计，按照早期临床试验质量标准开展确证性临床前研究。结果显示BRD4抑制剂JQ1单药在体外显著抑制肿瘤细胞增殖（效果与长春新碱相当），但未证实BRD4与CDK9抑制剂的协同作用。该研究为罕见病药物开发提供了高标准临床前研究范式。

　　

在儿童肿瘤领域，横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）作为一种恶性软组织肉瘤，始终是医学界面临的重大挑战。其中，携带PAX3::FOXO1（P3F）融合基因的亚型尤为凶险，晚期病例几乎无法治愈。传统化疗药物如长春新碱（vincristine）虽有一定疗效，但面对难治性病例往往束手无策。更令人担忧的是，基础研究成果向临床应用的转化率极低，许多在实验室中表现优异的候选药物在后续研发中折戟沉沙。这种"从实验室到临床"的转化困境，在罕见病和儿童癌症领域表现得尤为突出。

究其原因，学术驱动的研究往往存在样本量不足、治疗分组不当、质量控制缺失以及阴性结果报告不全等系统性偏差。巨大的发表压力进一步加剧了这种偏见。如何获得更稳健的临床前数据，成为提高新药研发成功率的关键。《Biomedicine 》近期发表的一项开创性研究，为这一难题提供了新的解决方案。

这项名为EPICYCLE的研究首次在学术环境中构建了一个多中心、随机、双盲的临床前研究平台，严格遵循早期临床试验的质量标准。研究团队将目光投向表观遗传调控领域，重点关注BET溴结构域蛋白4（BRD4）和细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）这两个关键靶点。理论依据在于：P3F融合癌蛋白与主转录因子MYCN、MYOG、MYOD共同招募超级增强子，建立自动调节环路，而BRD4正是维持这一致癌转录程序的核心。CDK9作为阳性转录延伸因子（p-TEFb）的催化亚基，可被BRD4招募，理论上两者抑制剂可能产生协同效应。

研究人员建立了一套完整的研究体系，涵盖患者来源的异种移植（PDX）模型、二维细胞培养、三维类器官培养和小鼠体内实验。关键技术方法包括：多中心协调的随机双盲实验设计、基于STR分析的细胞株认证、WST-1和CellTiter-Glo?活力检测、Annexin V-APC/7AAD凋亡分析、以及皮下和肌肉内移植瘤模型。研究使用了7种低传代P3F+ RMS细胞系，实验在5个研究中心并行开展，并设立了独立的数据协调中心。

JQ1抑制单层培养RMS细胞增殖

在二维培养实验中，JQ1单药使P3F+ RMS细胞生长平均减少60%，效果显著优于CDK9抑制剂CDKI73（平均减少24%）。虽然两药联合使用效果强于单药，但未达到预设的协同作用标准。值得注意的是，JQ1的抗增殖效果与经典化疗药长春新碱相当。在分子水平上，JQ1单药或联合用药显著降低了P3F、MYCN、MYOG和MYOD1的表达，证实了药物的靶向活性。

JQ1降低RMS细胞中P3F、MYCN、MYOG和MYOD1表达

通过Western blot和PCR分析，研究人员证实JQ1能够有效抑制关键癌基因的表达。尽管蛋白质印迹因样品质量问题受到影响，但PCR结果明确显示，JQ1单独或联合用药均可降低目标基因的转录水平，这一发现在不同研究中心之间具有高度一致性。

JQ1对RMS细胞具有促凋亡作用

凋亡实验结果显示，JQ1处理使细胞活力平均降低40%，同时使凋亡细胞比例增加81%，晚期凋亡/坏死细胞增加86%。CDKI73单独使用效果有限，两药联合仍未表现出协同效应，进一步证实了JQ1单药的主导作用。

JQ1抑制RMS类器官的3D生长

在更接近体内环境的三维类器官模型中，JQ1同样表现出显著的生长抑制效果（平均减少70%），而CDKI73的效果相对较弱（平均减少44%）。基因表达分析再次验证了JQ1的靶向作用，表明其疗效不受模型系统影响。

JQ1对人RMS异种移植瘤生长有轻微作用

体内实验遇到较多挑战，包括移植瘤发生率低、潜伏期变异大以及药物毒性问题。尽管如此，JQ1治疗仍显示出延缓肿瘤生长的趋势（平均减少36%）。然而，与体外实验不同，肿瘤组织中的靶基因表达未见明显变化，提示药物在体内的生物利用度可能不足。

JQ1延迟小鼠RMS细胞移植瘤形成

在肿瘤形成实验中，JQ1单药显著延长了移植瘤出现的时间，而CDKI73反而缩短了潜伏期。两药联合使用导致较高的胃肠道毒性发生率（75%），这与此类药物临床研究中观察到的不良反应相似。

JQ1和CDKI73对小鼠具有明显的胃肠道毒性

安全性评估发现，药物联合使用组的不良事件发生率显著升高，特别是胃肠道毒性占关联性事件的75%。通过调整药物配制方案，后续实验中药物耐受性得到改善。

不同RMS细胞间的药物反应差异可评估

多中心数据使得评估不同患者来源肿瘤细胞的异质性成为可能。研究发现不同细胞系对长春新碱的敏感性存在差异，但对JQ1和CDKI73的反应相对一致。

研究结论与讨论部分强调，这项研究成功证明了在学术环境中实施符合临床试验标准的确认性临床前研究的可行性。尽管主要研究目标——证实BRD4与CDK9抑制剂的协同作用——未能实现，但研究获得了许多宝贵发现。JQ1单药在体外表现出与长春新碱相当的抗肿瘤活性，其靶向作用通过多个分子标志物的下调得到确认。

然而，体内实验的局限性也显而易见：药物生物利用度不足、毒性反应明显以及靶点抑制证据不足，这些都提示在将此类表观遗传药物推向临床前，需要进一步优化给药方案和化合物选择。特别值得注意的是，研究中观察到的胃肠道毒性与近期BRD4和CDK抑制剂临床 trials 中报道的不良事件高度一致，这反而证明了临床前模型预测临床毒性的价值。

这项研究建立的平台与现有的儿科临床前测试项目（如NCI支持的PPTP和欧洲的ITCC-P4）相辅相成，但独特之处在于其完全由研究者发起，并创新性地将随机双盲设计应用于多中心临床前研究。对于罕见病和儿童癌症领域，这种高标准的研究范式能够最大程度地提高临床前数据的质量，避免将有缺陷的数据从实验室推向临床，从而节约宝贵的临床开发资源，避免患者参与无效试验，提高早期临床试验的成功率。

EPICYCLE研究为学术界开展高质量临床前研究树立了新标杆，其建立的方法学框架可适应于未来各种优化研究。随着更多类似研究的开展，我们有望见证儿科肿瘤药物研发进入一个更加严谨、高效的新时代。