镰状细胞病基因治疗新策略：碱基编辑与慢病毒转导在小鼠模型中展现优于CRISPR-Cas9的潜力

《Blood Advances》：Comparative Analysis of CRISPR-Cas9, lentiviral transduction, and base editing for sickle cell disease in a murine model

本研究针对镰状细胞病（SCD）基因治疗中不同策略的优劣尚不明确的问题，研究人员在免疫缺陷小鼠模型中系统比较了CRISPR-Cas9编辑、慢病毒转导和碱基编辑三种方法的疗效。结果表明，碱基编辑和慢病毒转导在降低红细胞镰变方面显著优于CRISPR-Cas9，为SCD的临床治疗策略选择提供了重要参考。

　　

镰状细胞病（Sickle Cell Disease, SCD）是一种由β-珠蛋白基因（HBB）点突变引起的遗传性血液疾病。该突变导致血红蛋白β链第六位谷氨酸被缬氨酸取代，产生异常的血红蛋白S（HbS）。在低氧条件下，HbS会发生聚合，使原本柔软圆润的红细胞扭曲成僵硬的镰刀状。这些镰状红细胞不仅寿命缩短导致贫血，更容易堵塞微小血管，引发剧烈疼痛、器官损伤以及一系列危及生命的并发症。SCD在全球范围内影响数百万人，目前唯一的根治性疗法是造血干细胞移植，但面临配型难、免疫排斥等巨大挑战。

近年来，基因治疗为SCD患者带来了新的希望。其中，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术和慢病毒载体介导的基因递送方法已在临床试验中展现出令人鼓舞的效果。CRISPR-Cas9策略通常靶向胎儿血红蛋白（HbF）的抑制因子BCL11A基因，通过破坏其增强子区域重新激活γ-珠蛋白的表达，用正常的HbF来补偿有缺陷的HbS，从而抑制镰变。而慢病毒转导则是将经过工程改造、能表达抗镰变血红蛋白的基因直接导入患者自身的造血干细胞和祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPCs）中。尽管这两种方法都取得了进展，但究竟哪种策略更安全、更有效，目前仍无定论。此外，新兴的碱基编辑技术作为一种能够直接、精确地改变DNA单个碱基而不造成双链断裂的工具，理论上可能具有更低的基因毒性风险，但其在SCD治疗中的潜力与上述成熟方法的对比评估尚属空白。

为了解决这一关键问题，由Henna Butt、Shruti Sathish、Francis J. Pierciey、Selami Demirci等来自美国国家心肺血液研究所（NHLBI）/国立卫生研究院（NIH）的研究团队开展了一项精心设计的比较研究。他们在免疫缺陷的NBSGW小鼠模型中，平行评估了CRISPR-Cas9编辑、慢病毒转导和碱基编辑三种方法治疗SCD的效果。该研究旨在为未来临床治疗路径的选择提供至关重要的临床前证据。相关研究成果发表在《Blood Advances》杂志上。

为开展本研究，研究人员主要应用了几项关键技术：首先，他们从SCD患者来源的CD34⁺ HSPCs入手，在体外（ex vivo）分别进行CRISPR-Cas9（靶向BCL11A增强子）、腺嘌呤碱基编辑器（实现特定碱基转换）以及慢病毒（携带抗镰变β-珠蛋白转基因）处理。随后，将这些经过处理的细胞移植到经白消安（busulfan）预处理的NBSGW免疫缺陷小鼠体内，建立人源化嵌合小鼠模型。在移植后16周，通过流式细胞术分析小鼠骨髓（Bone Marrow, BM）中人造血细胞（hCD45⁺）的植入情况；采用深度测序等技术精确量化各种编辑效率；并通过体外低氧诱导实验来评估不同治疗组来源的红细胞抑制镰变的效果。

人类CD45⁺细胞植入水平相当

移植后16周，对小鼠骨髓进行分析显示，所有实验组（包括CRISPR-Cas9编辑组、碱基编辑组、慢病毒转导组以及竞争性移植组）均实现了高水平且相当的人源细胞植入，人类CD45⁺细胞的比例在75%至90%之间，表明不同基因治疗方法均能支持HSPCs在小鼠体内成功定植和增殖。

BCL11A增强子编辑效率存在差异

在竞争性移植实验中（即将经过不同方法处理的细胞混合后移植），分析发现CRISPR-Cas9组中BCL11A增强子区域的编辑效率低于碱基编辑组和慢病毒转导组。这表明在体内竞争环境下，CRISPR-Cas9编辑的HSPCs可能在某些方面存在劣势。二次移植实验的结果进一步验证了这一发现，证明了编辑效率差异的可持续性。

碱基编辑与慢病毒转导在抑制红细胞镰变方面表现更优

抗镰变功能分析是评估治疗效果的核心指标。研究人员将从小鼠骨髓中分离出的造血细胞进行体外红系分化，然后进行低氧诱导的镰变实验。结果发现，与CRISPR-Cas9编辑组相比，碱基编辑组、慢病毒转导组以及竞争性移植组来源的红细胞，其镰变比例显著降低。这表明，在功能性纠正红细胞表型方面，碱基编辑和慢病毒转导策略比CRISPR-Cas9介导的BCL11A增强子编辑产生了更强的抗镰变效果。

本研究通过严谨的平行比较得出结论：尽管CRISPR-Cas9、慢病毒转导和碱基编辑这三种基因治疗方法在SCD小鼠模型中均能实现有效的造血重建并展现出治疗潜力，但在关键的改善红细胞功能指标上，碱基编辑和慢病毒转导的表现优于CRISPR-Cas9。这一结果提示，对于SCD的基因治疗，选择不同的技术路径可能会对最终临床疗效产生显著影响。碱基编辑作为一种新兴技术，在本研究中显示出与相对成熟的慢病毒转导方法相媲美的效力，同时其避免DNA双链断裂的特性可能带来安全性优势，值得进一步深入探索。该研究为未来SCD乃至其他单基因遗传病的精准基因治疗策略开发提供了宝贵的临床前数据支持和方向指引。