综述：调节性T细胞预防移植物抗宿主病的方法

《Current Opinion in Immunology》：Regulatory T cell approaches for graft-versus-host disease prevention

这篇综述系统阐述了调节性T细胞（Treg）在造血细胞移植（HCT）中预防移植物抗宿主病（GVHD）的最新进展，重点探讨了Treg的免疫抑制机制（如IL-10、TGFβ）、多种体外扩增与基因工程策略（如CAR-Treg），以及临床转化成果（如Orca-T方案），强调了其在抑制异体反应性T细胞同时保留移植物抗肿瘤（GVT）效应的独特优势。

　　

引言

调节性T细胞（Treg）是免疫系统的有效抑制细胞，能够维持和恢复免疫平衡。它们通常通过表面表达CD4、CD25以及低表达CD127来定义，约占成人外周血单个核细胞的1%，并以表达主转录因子叉头框P3（FOXP3）为特征。Treg通过维持外周耐受来预防自身免疫疾病并控制对病原体的炎症反应。随着临床级方法的发展，能够高纯度地筛选Treg，基于Treg的过继性细胞疗法已被探索用于预防不良免疫激活，例如在1型糖尿病等自身免疫疾病以及实体器官移植等异体免疫中的应用。另一个有前景的适应症是预防造血细胞移植（HCT）后的移植物抗宿主病（GVHD）。

HCT仍然是治疗多种恶性及非恶性疾病的唯一根治性方法，涉及将供体CD34⁺造血干细胞和祖细胞（HSPC）移植到经过预处理的受者体内。供体移植物中的常规CD4⁺和CD8⁺ T（Tcon）细胞提供有益的免疫力和移植物抗肿瘤（GVT）效应，但也能通过识别健康组织上表达的HLA和次要移植抗原而引起GVHD。GVHD进一步分为急性和慢性两种形式。急性GVHD通常发生在HCT后的前100天内，以健康组织（包括皮肤、肝脏和肠道）的过度炎症为特征。慢性GVHD通常诊断于HCT后100天之后，表现为自身免疫样疾病，是供体来源的免疫系统失去耐受的最终结果。急性GVHD是慢性GVHD的一个重要风险因素，说明HCT后早期的免疫失调可能产生长期影响。

当前GVHD预防的标准护理包括使用甲氨蝶呤和他克莫司等钙调神经磷酸酶抑制剂来抑制异体反应性T细胞的激活。尽管进行了显著的免疫抑制，仍有30-50%的异基因HCT受者会受到GVHD的影响。此外，多达一半的急性GVHD患者会发展为激素难治性，这表明需要新的预防性疗法，以限制长期免疫抑制和基于皮质类固醇治疗的负面后果。移植后环磷酰胺的使用是GVHD控制的一大进展，尤其是在单倍体相合移植中。然而，GVHD仍然是一个重大问题，并且这种方法带有其他毒性的风险，例如内皮炎症以及心脏和肾脏的器官损伤，因此正在进行研究以评估移植后环磷酰胺的剂量减少。本综述将重点介绍基于Treg的细胞疗法预防GVHD的方法，并强调近期的科学和临床进展。

Treg与控制异体反应性：组织依赖性机制

Treg抑制炎症反应的机制已在小鼠和人类中进行了长期研究。大量报告发现了多种导致免疫抑制的过程，包括表达调节性细胞因子如白细胞介素（IL）-10和转化生长因子（TGF）β、细胞外ATP的隔离和转化、IL-2剥夺、程序性细胞死亡蛋白（PD）-1等共刺激信号、抗原呈递细胞的细胞毒性杀伤以及组织支持功能。虽然仍有许多需要了解，但Treg的抑制功能通常具有情境特异性，并涉及一系列靶细胞类型和组织类型特异性的功能。总体而言，作为概念验证，小鼠研究早已证明，在供体移植物中富集Treg能有效控制异体反应性T细胞的扩增和GVHD。小鼠Treg需要归巢到淋巴组织，并且需要表达淋巴归巢受体CD62L才能在体内发挥作用。最近的工作在异基因HCT后追踪小鼠T细胞的命运，发现供体Treg也归巢到非淋巴组织，并采用组织特异性基因表达谱，尤其是在GVHD靶组织中。此外，这种组织归巢似乎至少部分由T细胞受体（TCR）特异性驱动，表明Treg对同源抗原的识别可能在异基因HCT后的归巢和功能中很重要。小鼠的其他研究也发现，异基因HCT后，Treg在淋巴结部位被激活，导致常规T细胞增殖和炎症基因表达的改变。尽管Treg调节一般的炎症反应，但涉及Tcon激活及其对血液恶性肿瘤直接细胞毒性的通路似乎没有改变。这些发现为预防GVHD和保留GVT效应提供了一种机制，即需要Tcon的激活，但控制了以GVHD反应失调为特征的大规模Tcon扩增。实际上，相同的机制可能解释了Tcon在保留对抗病原体活性的同时，Treg能抑制GVHD的能力。

评估Treg在人类GVHD中的影响——尤其是在靶组织内——已被证明比在小鼠中困难得多，后者利用强大的临床前研究来评估异基因HCT后Treg的功能，并建立模型来说明Treg如何影响免疫重建和HCT结果。然而，最近越来越多的研究揭示了人类中潜在的机制。例如，异基因HCT后的人类骨髓活检表明，促炎性CD161⁺ Treg可能参与GVT过程。其他研究人类微生物组与肠道Treg之间相互作用的研究发现，受者微生物群是代谢物的重要生产者，这些代谢物支持胃肠道Treg，而通过放化疗或抗生素暴露破坏微生物组可能导致体内Treg功能和丰度的丧失。确实，CD73⁺ DP8α Treg（对肠道共生菌Faecalibacterium prausnitzii特异）的缺失与人类急性GVHD相关。这些数据与以下范式一致：供体Treg归巢到特定组织，然后在其中介导独特的功能，以抑制GVHD，同时维持或促进GVT效应。因此，预防性疗法必须考虑Treg归巢到不同疾病靶向组织的能力。

Treg细胞疗法：克服制造挑战

由于Treg是外周血中的一个稀有亚群，人类研究在开发预防GVHD的Treg疗法时，试图在可行性和有效性之间取得平衡。因此，已经测试了多种策略来富集或扩增这些稀有细胞以达到预防GVHD的足够水平，或者提高其有效性从而减少所需细胞数量。例如，小鼠模型已经确定，同种抗原特异性Treg在过继转移后比多特异性Treg具有更强的免疫抑制作用。早期富集大量同种特异性人类Treg克隆的努力涉及慢病毒导入识别酪氨酸酶_368–376肽段（在常见HLA I类等位基因HLA-A*02背景下）的TCR。尽管存在抗原限制性（包括局部酪氨酸酶表达和HLA特异性）相关的局限性，这项工作为结合诱导抗原特异性和随后进行多克隆扩增的方法奠定了基础。该领域的其他工作通过用同种异体CD40L激活的B细胞刺激，然后进行非特异性再刺激以诱导扩增，产生了多克隆同种特异性人类Treg。一些小组还建立了同种异体B细胞库，用于按需针对特定HLA单倍型进行同种异体刺激。鉴于HCT中供受者HLA匹配的需求，其他人成功地用来自HLA相同同胞的细胞培养扩增了次要组织相容性抗原特异性Treg。

同种抗原特异性刺激的一个主要限制是前体细胞数量少，这限制了可产生的同种特异性Treg的数量。关于最大化转移的Treg总数，使用抗CD3和抗CD28刺激进行非特异性扩增仍然在异种移植模型中抑制GVHD并维持GVT效应。其他人在体外扩增中加入雷帕霉素，以优先诱导人类FOXP3⁺ Treg增殖并防止污染培养物的稀有非Treg细胞扩增，尽管总体扩增倍数可能因此受到限制。脐带血来源的Treg也进行了多克隆扩增，随后进行体外岩藻糖基化以改善向靶组织的归巢和持久性。因此，多克隆扩增使得能够大规模、临床相关地生产Treg，但缺乏受者抗原特异性以及对高浓度IL-2的依赖可能导致过继转移后持久性不足。

虽然大多数研究使用胸腺来源的自然Treg，但Treg也可以在外周诱导或从CD4⁺FOXP3^- T细胞体外产生。使用诱导性Treg（iTreg）的主要优势是常规T细胞的起始群体大、扩增要求降低，并且可能在细胞分离后更快输注。大量多克隆iTreg已被证明输注入人体是安全的，尽管其持久性也可能有限，类似于扩增的自然Treg。除了在培养条件中添加IL-2、TGFβ和雷帕霉素外，还使用了短发夹RNA策略敲低Th1转录因子T-bet，以限制促炎细胞因子的表达并在异种移植模型中保留人类iTreg的抑制功能。此外，通过体外用同种异体单核细胞来源的树突状细胞刺激和次级多克隆扩增，产生了人类同种特异性iTreg，说明了生成Treg疗法时的潜在模块化。在IL-10和同种抗原存在下培养扩增人类CD4⁺ T细胞也可以产生“失能”的T调节性1型细胞，这些细胞可以介导GVT而不参与异体反应性GVHD反应。总体而言，多种基于Treg的GVHD预防制造策略正在开发中，各有利弊。

用Treg疗法预防GVHD：临床转化

尽管有许多基于Treg的策略正在开发中用于预防GVHD，但由于需要产生具有临床意义的Treg数量以及用于临床生产的大规模良好生产规范（GMP）设施，临床转化十分困难。在美国和欧洲进行的涉及使用Treg预防GVHD的试验的全面列表可在表1中找到，我们将在此讨论一些关键的人类试验。

首次在人体中进行的1期试验使用了同种异体脐带血来源、经多克隆扩增的Treg，结果于2011年首次发表。在使用西罗莫司预防的双份脐带血移植后，与同期对照组相比，接受Treg治疗的个体II-IV级急性GVHD发生率降低了30%。然而，这种结合西罗莫司和霉酚酸酯预防的策略在2期试验中被撤回，因为尽管早期安全性试验结果令人鼓舞，但3名患者中有2名出现了严重的GVHD。

在单倍体相合移植中，在输注Tcon和CD34⁺ HSPC前2-4天给予Treg，已显示出显著的GVHD抑制作用，且未丧失GVT效应。值得注意的是，输注供体Treg与Tcon比例为2:1的细胞，即使在HLA单倍体不匹配的情况下，也允许完全撤除移植后免疫抑制。这些试验中最新的一项结合了年龄依赖的预处理方案，结果显示中度/重度慢性GVHD/无复发生存率为75%。在随机3期试验中确认这些结果将进一步支持这种移植策略在缺乏HLA匹配供者的患者中的广泛应用。

在HLA相合的异基因HCT中的研究由斯坦福大学与Orca Bio合作开发。这种名为Orca-T的策略是一种基于Treg的免疫疗法，涉及移植纯化的CD34⁺ HSPC以及确定比例的Tcon和Treg，目标比例为1:1。Orca-T依赖于在第0天移植HSPC和新鲜分选的Treg，并在2-3天后延迟输注减少数量的Tcon，同时使用单药他克莫司进行GVHD预防。临床前模型表明，过继转移后，Treg在体内扩增，并且在Tcon输注前48小时输注这些细胞，可以使Treg归巢到淋巴结部位并增强GVHD抑制。有趣的是，在Tcon输注后48小时给予Treg会导致临床益处消失，进一步证明了时机对Treg功能的重要性。1期和2期研究的 promising 结果确立了Orca-T疗法后急慢性GVHD发生率极低。重要的是，这些多机构研究中的非复发死亡率仅为3-4%，证明了Orca-T方法的安全性。非复发死亡率的降低是Orca-T治疗患者的一个重要特征，可能为探索这种方法用于其他已知异基因HCT有效的非恶性疾病铺平道路。此外，中度至重度GVHD和无复发生存率为67%，优于在同一机构治疗的同期患者队列。该策略已进展到最近完成的一项随机3期试验，测试Orca-T预防GVHD的效果。Orca-T目前也在HLA不匹配和单倍体相合HCT中进行评估，同时还有更新的Treg工程化移植物，这些移植物去除了幼稚Tcon（异体反应性T细胞富集的独特亚群）（称为Orca-Q）。Orca-Q目前正在HLA相合的异基因HCT中评估，且不使用额外的预防措施。总体而言，人类试验中基于Treg的GVHD预防疗法侧重于定时输注新鲜分离的Treg结合减少T细胞的移植物，结果支持Treg可以在不增加异基因HCT后患者复发风险的情况下预防GVHD的观点。

未来方向与结论

基于Treg的疗法预防GVHD的未来非常光明。虽然正在进行的临床试验侧重于新鲜分离的Treg，但许多小组仍在寻求克服与多克隆Treg扩增相关的问题，这可能对某些患者更有效。这些方法中有许多涉及Treg的基因修饰以改善其持久性或功能。例如，在小鼠Treg上表达正交IL-2受体，可以通过给予不与天然IL-2R结合的正交IL-2，实现体内特异的Treg支持和扩增。这种策略有助于克服Treg在体外扩增期间可能产生的极端IL-2依赖性，且没有刺激体内异体反应性T细胞的风险。

其他Treg工程方法涉及添加嵌合抗原受体（CAR）以促进对常见表达靶点的抗原特异性。由于多克隆扩增的Treg中有相当一部分不会对受者抗原产生反应，引入CAR可以确保足够的TCR样刺激以促进Treg的持久性和活性。在异种GVHD模型中显示有效的CAR Treg靶点实例包括CD19、CD83、HLA-A2和OX40L。其他工程策略涉及通过慢病毒将FOXP3导入人类常规CD4⁺ T细胞，产生多克隆Treg样细胞。其他人还工程化了诱导性人多能干细胞来源的CD4⁺ T细胞，使其同时表达FOXP3和抗HLA-A2 CAR，这些细胞在过继转移后抑制了异种GVHD。使用人类CAR-Treg的一个限制是其表型稳定性和转导Treg的细胞毒功能存在不确定性，其进一步的临床发展可能取决于使用更稳定的亚群，如CD39⁺ Treg。最后，人类CD8⁺ Treg（定义为CD8⁺CD45RC^low/neg）在引入HLA-A2 CAR后也被证明能抑制异种GVHD。工程化Treg疗法的下一步将涉及GMP级生产的规模化以及确定其在人体中的安全性，CAR-T细胞领域的先前发展无疑将为这一过程提供信息。

基于Treg的策略广泛用于预防GVHD的另一个重要步骤将是证明其在GVHD预防之外，相对于常规方法能带来临床改善。使用当前方案，优势包括能够减少或完全撤除额外的免疫抑制，这可能允许对病原体提供更好的保护或更强的移植物抗白血病效应。这一原理可以解释为何此处提及的Treg临床试验未报告感染或复发率增加，同时GVHD减少。在发生GVHD的患者中，基于Treg的疗法的另一个益处可能是对一线皮质类固醇和其他二级治疗的反应性改善。此外，几种基于Treg的策略涉及移植比常规异基因HCT更少数量的T细胞，以达到特定的Tcon与Treg比例。与常规HCT相比，这种精密设计的移植物可能会改善围移植期的可预测性，在常规HCT中，输注的T细胞数量在患者之间可能存在对数级的差异。尽管对接受减少T细胞库的患者存在短期免疫重建和T细胞受体库多样性的担忧，但迄今为止在临床试验中这些担忧尚未成为现实。因此，当前的机构指南可能适用于管理接受Treg疗法的患者，从而减轻采用此类新策略的负担。

总体而言，基于Treg的GVHD预防疗法在过去25年中取得了重大进展，既有成功的方法，也存在困难的方法。许多方案已成功转化为人体应用，其中一项最近完成了3期随机试验。随着更多Treg临床试验的进行，与新兴标准护理预防措施（如移植后环磷酰胺）的比较或组合，对于确定哪些患者最能从基于Treg的预防策略中受益至关重要。涉及Treg和降低强度预处理方案的额外试验将有助于将此类方法扩展到老年患者和合并症较多、无法耐受清髓方案毒性的患者。虽然一种“一刀切”的Treg预防GVHD方法不太可能成功，但根据HLA匹配程度、预处理方案和适应症选择个性化疗法，很可能为大多数异基因HCT受者提供GVHD预防的改善。此外，基于Treg的GVHD预防策略可能允许将异基因HCT扩展到其他免疫疾病，如严重自身免疫性疾病，以及在实体器官移植后诱导耐受。