综述：利用人iPSCs建立神经退行性疾病治疗方法

《Current Opinion in Neurobiology》：Towards the establishment of treatments for neurodegenerative diseases using human iPSCs

本篇综述系统阐述了人诱导多能干细胞(iPSCs)在神经退行性疾病治疗领域的应用前景，重点涵盖了基于iPSCs的细胞疗法、药物重定位(repurposing)以及针对散发性疾病的大型iPSC队列研究等前沿方向，为开发阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)等疾病的精准医疗策略提供了重要见解。

　　

背景

自2006年小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)首次成功建立以来，这项能够使已分化的体细胞重获多能性的技术引发了生物医学领域的范式转变。随后的研究迅速将人iPSCs的应用拓展至再生医学、疾病建模和药物发现等多个领域。这一突破是数十年干细胞研究积累的成果，从Gurdon的核移植实验，到Weintraub等人的MyoD研究，再到Thomson成功分离人胚胎干细胞(ESCs)，以及“多莉”羊的克隆实验，共同为iPSC技术奠定了理论基础。

干细胞与终末分化的体细胞不同，具有自我更新和分化成特定细胞谱系的能力。其中，包括ESCs和iPSCs在内的多能干细胞，能够分化为所有细胞类型，为生物学研究和医学应用提供了强大的工具。iPSCs的出现，使得从患者个体生成新型细胞资源成为可能。

长期以来，神经系统被视为非再生器官，其研究因难以获取患者来源的活体组织而受限。iPSCs技术及其定向分化为神经谱系方法的成熟，使得高效诱导神经祖细胞、功能性神经元和胶质细胞成为现实，并促进了类器官和组装体的构建。此外，微生理系统(MPS)等三维培养平台的发展，使得构建在结构和功能上高度模拟体内环境的神经组织模型成为可能。

神经退行性疾病疗法利用人iPSCs

(1) 细胞疗法的研究与开发

在神经退行性疾病的细胞治疗中，目标是将在体外由iPSCs分化而来的神经细胞或神经祖细胞移植到大脑或脊髓的特定区域，以恢复受损的功能。实现临床应用需要攻克多个关键环节，包括分化细胞的纯化、残留未分化细胞的清除、致瘤性的预防以及严格的安全性和有效性评估。尤为重要的是，避免免疫排斥的策略也在不断演进，例如结合HLA配型、免疫抑制、利用CRISPR-Cas9技术进行HLA基因编辑以及引入免疫调节因子以降低免疫原性。同时，诸如“自杀基因”等安全措施也在探索中。这些方法相结合，有望实现仅需最小剂量免疫抑制剂即可进行的同种异体移植，从而拓宽并加速细胞疗法的可及性。

帕金森病(PD)是目前细胞移植治疗研究最为深入的疾病领域。该领域始于胎儿组织移植，随后经历了使用ESC和iPSC来源的多巴胺能祖细胞进行临床前研究的阶段，目前已进入临床研究阶段，并已有安全性和有效性的报道。基于自体iPSCs的移植研究也在进行中，标准化细胞产品的生产流程正在逐步建立。

肌萎缩侧索硬化(ALS)也是细胞移植的探索目标，该领域已积累了大量的基础研究。早期研究始于使用胎儿来源的神经干细胞进行的I期临床试验，结果证实了安全性并在部分患者中观察到功能改善。近期，一项使用经过工程化改造、能够分化为表达胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的星形胶质细胞谱系的胎儿来源神经祖细胞进行的I/IIa期试验显示，移植侧肌肉力量有得以维持的趋势。

在脊髓损伤研究方面，基于iPSCs的神经干细胞移植已显示出良好的安全性，在为期一年的随访中未发现肿瘤形成或严重不良事件。尽管样本量较小，但仍观察到了功能改善的趋势。其他临床前研究也提示，iPSC疗法在神经退行性疾病、脑梗死、多发性硬化以及罕见儿科疾病等领域具有广阔的应用潜力。

(2) 药物发现与开发

从ALS患者成功获得首个患者来源iPSCs，为疾病建模开启了新纪元。基于iPSCs的模型不仅促进了机制研究和大规模药物筛选，还推动了小分子药物、抗体、反义寡核苷酸(ASOs)和基因疗法等多种治疗模式的发展。

药物重定位是一种尤为强大的策略。已上市药物具备已知的安全性、耐受性和药代动力学数据，能够实现更快、更具成本效益的临床转化。重定位不仅能将开发成本降至传统药物发现的十分之一，还能显著缩短研发时间，并可能揭示新的靶点和生物标志物。

此前，研究者利用化学生物学方法，对一个包含1416种已上市药物的库进行了ALS治疗药物筛选。通过建立基于Lhx3、Ngn2和Isl1过表达的诱导运动神经元(iMN)系统，筛选出27个候选化合物，其中半数靶向Src/c-Abl通路。博舒替尼(Bosutinib)通过抑制Src/c-Abl，可增强自噬、减少蛋白聚集、改善运动神经元存活、穿透血脑屏障，并能延长ALS模型小鼠的生存期。随后的iDReAM临床研究显示，部分患者功能衰退速度减缓，且应答者的基线神经丝轻链水平较低。反向转化研究通过对iPSC来源的运动神经元进行单细胞RNA测序，揭示了应答患者中与发病机制相关的分子特征。Src/c-Abl抑制剂在阿尔茨海默病和帕金森病的临床试验中也显示出积极信号，表明Src/c-Abl通路可能是神经退行性疾病中神经元细胞死亡的共同分子靶点。基于iPSCs的方法还发现了其他可用于ALS的重定位药物，如针对皮层和脊髓运动神经元过度兴奋的瑞替加滨(Retigabine)，以及抑制氧化应激的罗匹尼罗(Ropinirole)。通过精确分析iPSC模型的细胞表型并剖析潜在的疾病病理生理学，未来的iPSC治疗研发有望从传统的针对疾病的治疗，转向识别靶向特定细胞表型的药物及其组合。

阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性记忆和其他认知功能损害以及不可逆神经退行为特征的神经疾病。其主要的神经病理学标志是主要由Aβ和tau蛋白构成的老年斑和神经原纤维缠结。能够重现Aβ和tau积累的iPSC模型已被用于评估抗体疗法和靶向蛋白降解药物。利用源自表现AD样病理的唐氏综合征患者的iPSCs分化皮层神经元，研究人员开发了一个药物筛选平台，用于识别能改变Aβ₃₈:Aβ₄₂比率的化合物。该方法成功发现了γ-分泌酶调节剂E2012，并已进入I期临床试验。此外，利用携带APP重复突变的家族性AD患者iPSC来源神经元进行筛选，发现抗HIV药物依非韦伦(Efavirenz)可通过抑制胆固醇生物合成通路来减少tau蛋白磷酸化。一项针对早期AD患者的I期临床试验已经完成。受利用iPSC来源神经元定量检测Aβ作为筛选指标的启发，研究者从现有药物中鉴定出溴隐亭(Bromocriptine)是最有效的化合物，目前正推进其进入临床试验。这些发现表明，iPSC模型不仅可用于通过筛选识别有效候选药物，还能用于对最可能从特定疗法中获益的患者亚群进行分层。

神经退行性疾病领域存在大量未满足的医疗需求，预计通过iPSC筛选鉴定的药物临床试验将持续进展。然而，iPSC药物重定位的实际应用面临一些操作挑战，包括当新目标患者群体特征与现有适应症不同时仍需进行临床试验评估药代动力学和不良事件、制药公司开发动力有限、以及重定位候选药物需符合公司战略发展重点等。为避免临床转化进程放缓，需要建立新的框架来应对这些挑战。

在药效评估的同时，应用基于iPSCs的检测方法来发现不良反应（毒性）也在取得进展。iPSCs分化的神经元能够可视化并操控在分化的体细胞中难以重现的神经元功能，使其成为检测药物诱导的神经毒性、脱靶效应和神经系统特异性不良反应的强大体外模型。将预测性体外人体毒性测试纳入安全性评估已得到包括美国FDA在内的国际机构推荐，并被视为可替代动物实验的、具有重要社会意义的药物开发策略。

利用人iPSCs进行发病预测和诊断支持的病理生理学阐释

在神经退行性疾病中，不可逆的神经元丧失随时间推移而发生。因此，通过先进的发病预测技术实现准确诊断和早期治疗干预至关重要。神经退行性疾病治疗的临床试验一致表明，在疾病早期阶段开始治疗可增强疗效。然而，许多神经退行性疾病是散发性的，缺乏单一可识别的致病基因，这使得早期诊断充满挑战。

发病机制谱的范围很广，从由效应强的罕见变异驱动的情况，到由众多效应微小的常见变异共同增加疾病风险的多因素情况。理解这种遗传结构有助于阐明神经退行性疾病的遗传性。重要的是，即使致病基因未知，也可以从患者iPSCs生成神经细胞。这种能力促成了针对散发性神经退行性疾病的大规模iPSC队列的构建，结合先进的多组学分析，使得生物标志物发现、发病预测和诊断支持研究成为可能。

一项研究利用从53名有多基因风险记录的AD供者建立的iPSC来源神经元以及来自同一供者的配对脑组织进行了RNA和蛋白质组学分析。分析结果显示，iPSC来源神经元再现了在体大脑中观察到的蛋白质网络特征，证明遗传性AD风险可以在细胞水平上得到反映。在此基础上，从根据多基因风险评分(PRS)高低筛选出的超过100名AD供者建立的iPSC系，有望成为剖析包括AD在内的多因素疾病病理生理学和识别治疗候选物的新平台。研究者从102名散发性AD患者生成iPSCs，诱导分化为皮层神经元，并量化其分泌的Aβ量，将其作为细胞特异的定量表型。基于此表型进行的全基因组关联研究（细胞GWAS）不仅重现了临床GWAS已报告的基因位点，还识别出与散发性AD致病表型相关的新的罕见风险变异。此外，源自细胞GWAS的多基因信息能够预测独立临床队列（ADNI研究）中的大脑Aβ积累。通过整合这些结果，研究者开发了一个将iPSC为基础的细胞GWAS发现与临床预测联系起来的框架，命名为多基因性细胞剖析(CDiP)技术。这种整合方法阐明了散发性AD的风险评估和药物靶点发现，并可应用于基于遗传数据的真实世界发病预测。最终，CDiP技术也可能有助于更深入的个性化诊断和新的替代标志物的开发。

在ALS研究中，Answer ALS联盟建立了来自92名健康对照和341名ALS患者的433个iPSC系。这些细胞使用标准化的32天方案分化为运动神经元。对所得细胞进行了免疫染色和RNA-seq分析，并对来自380名ALS患者和80名对照的iPSC来源神经元进行了ATAC-seq。在统计上校正性别、iPSC来源细胞类型和祖源背景后，研究人员识别出ALS特异性的染色质可及性改变，并且这些改变与疾病进展速度相关。在最近的ALS建模研究中，一项研究分析了来自180名个体（包括散发性ALS患者、C9orf72-ALS/FTD病例和对照）的iPSC来源神经元，研究了TDP-43功能丧失的分子特征。通过针对20个基因的大约32,500次qRT-PCR测量，作者识别出了时间依赖性和异质性的分子特征，这些特征在同一患者的尸检脑组织中也得以观察到。Zhang等人从ALS患者iPSCs分化的运动神经元中获得了转录组和表观基因组数据，并利用机器学习将这些数据与GWAS结果整合，识别出与ALS风险相关的新基因。研究者推进了基于人工智能的iPSC来源神经元图像数据分析，这些图像反映了即使是散发性疾病中全基因组遗传背景的综合效应。具体而言，将来自15名散发性ALS患者和15名健康供者的iPSCs分化为运动神经元，每位供者获取约7000张细胞图像。利用这些图像，训练了一个深度学习模型，该模型能以超过90%的准确率区分ALS来源和对照来源的运动神经元。模型解释揭示，AI主要关注胞体和神经突的形态特征进行分类。这种iPSC技术与AI的结合，为ALS的早期诊断支持提供了一条充满希望的路径。

未来展望

在利用人iPSCs进行神经退行性疾病治疗的研究和临床应用中，如上所述，正显现出两大趋势。首先，与基因治疗的结合正在推动细胞移植的发展。通过在iPSC平台中整合疾病修饰性或恢复性的基因编辑，例如基因校正、保护性基因的引入或致病等位基因的沉默，有望实现根本性的疾病控制。与此同时，治疗开发流程将加强细胞产品的质量保证，并建立符合药品生产质量管理规范(GMP)的生产体系。从分化成所需细胞类型的效率和稳定性角度来看，使用初始态iPSCs来生产细胞治疗产品有望进一步提高产品的一致性和功能性。其次，在药物发现方面，已积累和未来的iPSC衍生数据集有望催生iPSC数字孪生和整合基因组、表型和药理学数据的患者特异性生物学计算化身。这对于目前缺乏有效疗法的大量罕见病尤为重要。利用罕见病患者iPSCs进行疾病建模，结合人工智能、生物信息学、类器官和MPS等先进技术，有望为治疗发现和开发开辟新途径。

综上所述，这些方向指向一个未来：基于iPSC的平台将不仅作为实验模型，更将作为预测性精准医疗工具发挥作用，实现个性化治疗策略，并加速从实验室发现到临床干预的转化。