多组学生物信息学联合体内外实验揭示异川楝素的肾毒性风险及PI3K/AKT通路调控机制

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Multi-level bioinformatics combined with in vitro and in vivo experiments reveal the nephrotoxicity risk of isotoosendanin

本研究针对天然化合物异川楝素（ITSN）的肾毒性机制尚不明确的问题，通过整合网络毒理学、分子对接与动力学模拟、体外细胞实验及体内动物模型，首次系统评估其肾毒性风险。研究发现ITSN通过抑制PI3K/AKT信号通路，激活CASP3等核心靶点，诱导氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，导致肾小球和肾小管结构损伤。该研究为ITSN作为生物农药和抗肿瘤药物的安全应用提供毒理学依据，并为天然化合物的毒性评估策略提供新范式。

　　

在传统中药和现代农业中，楝科植物因其显著的杀虫活性而被广泛开发利用，其中川楝子（Fructus Meliae Toosendan, FMT）已成为一种重要的生物农药资源。然而，与其广泛应用形成鲜明对比的是，FMT潜在的毒性风险——尤其是肝肾功能损伤——始终是悬而未决的安全隐患。异川楝素（Isotoosendanin, ITSN）作为FMT中的主要柠檬苦素类化合物，虽在抗寄生虫、抗炎镇痛乃至抗肿瘤方面展现出良好的药理活性，但其具体的毒理学机制，特别是对肾脏的影响，却如同迷雾笼罩，亟待揭示。传统单一层面的毒理学研究方法已难以满足对这类天然化合物进行快速、精准毒性评估的需求。

正是在这一背景下，研究人员决心揭开ITSN肾毒性的神秘面纱。他们采用了一种创新的多层级研究策略，将前沿的生物信息学预测与经典的实验验证紧密结合，旨在系统阐明ITSN的肾毒性风险及其作用机制。这项研究成果已发表在环境与健康领域的重要期刊《Ecotoxicology and Environmental Safety》上。

为了高效地开展研究，团队运用了几项关键技术：首先，利用网络毒理学方法，通过SwissTargetPrediction、SEA和PharmMapper等数据库预测ITSN的潜在作用靶点，并与GeneCards、OMIM数据库中的肾病相关靶点进行比对，筛选出共同靶点。其次，借助STRING数据库构建蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape软件中的cytoHubba插件识别核心靶点。接着，采用AutoDock Vina等软件进行分子对接，评估ITSN与核心靶点的结合能力，并利用Gromacs软件进行分子动力学（MD）模拟，分析复合物的稳定性。在实验层面，研究使用了人肾近曲小管上皮细胞系（HK-2）进行体外培养，通过CCK-8法检测细胞活力，划痕实验评估细胞迁移，流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（ROS）水平，Western blot和实时荧光定量PCR（RT-PCR）分析相关蛋白和基因的表达。在体内实验中，团队使用了C57BL/6J小鼠模型，通过灌胃给予不同剂量ITSN，检测血清肌酐（CREA-S）和尿素（UREA）水平，并对肾组织进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson染色、TUNEL染色和免疫组织化学染色等病理学评估。

3.1. 网络毒理学预测分析ITSN

研究伊始，通过ADMETlab 3.0和美國環境保護署（EPA）数据库对ITSN进行毒性预测。结果显示，ITSN具有较高的肾毒性风险（概率为0.918），同时表现出一定的环境毒性。通过数据库筛选，最终获得116个ITSN诱导肾毒性的潜在作用靶点。

3.2. 获取核心靶点与PPI网络

将116个潜在靶点输入STRING数据库构建PPI网络，该网络包含116个节点和1180条边。利用Cytoscape软件进一步分析，筛选出连接度最高的10个核心靶点，包括CASP3、EGFR、MTOR等。

3.3. GO功能富集与KEGG通路富集分析

对潜在靶点进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。GO分析显示，这些靶点显著富集于细胞凋亡、炎症反应等生物过程。KEGG分析提示，PI3K/AKT信号通路是ITSN可能作用的关键通路。

3.4. ITSN与核心靶点的分子对接

分子对接结果表明，ITSN与10个核心靶点（如CASP3、EGFR、MTOR）均能以较低的结合能（均低于-5 kcal/mol）稳定结合，提示其与这些靶点存在较强的相互作用潜力。

3.5. 分子动力学模拟分析

对ITSN与CASP3、HSP90AB1、EGFR、HSP90AA1、MTOR五个核心靶蛋白的复合物进行了100纳秒的分子动力学模拟。通过分析均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和氢键数量等参数，证实了ITSN与这些靶蛋白结合后的复合物结构具有良好的稳定性。

3.7. ITSN抑制HK-2细胞的增殖和迁移

体外实验发现，ITSN能以浓度依赖的方式抑制HK-2细胞的活力，其48小时的半抑制浓度（IC₅₀）约为65.19 μM。划痕实验结果表明，ITSN显著抑制了HK-2细胞的迁移能力。

3.8. ITSN诱导HK-2细胞凋亡

流式细胞术检测显示，ITSN处理可浓度依赖性地增加HK-2细胞的凋亡率。Western blot结果进一步证实，ITSN能上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的蛋白水平以及Bax/Bcl-2的比值，而下调Caspase-3和Caspase-9的蛋白水平。RT-PCR结果也显示BAX mRNA表达上调，BCL-2 mRNA表达下调。这些结果共同表明ITSN能诱导HK-2细胞发生凋亡。

3.9. ITSN诱导HK-2细胞ROS积累并升高炎症因子水平

流式细胞术检测发现ITSN处理能浓度依赖性地增加HK-2细胞内活性氧（ROS）的水平。RT-PCR实验表明，ITSN处理显著上调了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的mRNA表达水平，提示ITSN可引发氧化应激和炎症反应。

3.10. ITSN在体外调控五个核心靶点的表达

RT-PCR实验检测了五个核心靶点（CASP3, HSP90AB1, HSP90AA1, EGFR, MTOR）的mRNA表达水平。结果显示，随着ITSN浓度增加，CASP3、HSP90AB1和HSP90AA1的mRNA水平呈浓度依赖性上升，而EGFR和MTOR的mRNA水平则显著下降，验证了生物信息学预测的部分结果。

3.11. ITSN在体外对PI3K/AKT信号通路的影响

Western blot分析显示，ITSN处理能浓度依赖性地降低磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）的蛋白水平。此外，使用PI3K激动剂740Y-P可部分逆转ITSN对HK-2细胞活力的抑制作用，表明ITSN可能通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制细胞增殖。

3.12. ITSN体内肾毒性的组织病理学评价

体内动物实验表明，给予30 mg/kg ITSN的小鼠，其血清肌酐和尿素水平显著升高。肾组织H&E染色显示该剂量组小鼠出现肾小球结构异常、肾小管管腔狭窄、间质炎症细胞浸润等病理改变。Masson染色未发现明显的纤维化。RT-PCR结果显示肾组织中TNF-α和IL-1β的mRNA表达上调。

3.13. ITSN在体内调控核心靶点、抑制PI3K/AKT通路并诱导凋亡

TUNEL染色显示30 mg/kg ITSN处理组小鼠肾组织中的凋亡细胞显著增多。免疫组织化学染色显示p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平随着ITSN浓度增加而降低。RT-PCR结果同样证实了ITSN在体内对五个核心靶点mRNA表达的调控作用。

讨论与结论

本研究通过多层次的研究方法，首次系统地揭示了ITSN的肾毒性风险及其分子机制。研究表明，ITSN的肾毒性作用与其抑制PI3K/AKT信号通路密切相关，该通路的抑制进而导致细胞凋亡的激活、氧化应激水平的升高以及炎症反应的加剧。研究确认了CASP3、HSP90AA1、HSP90AB1、EGFR和MTOR等核心靶点在ITSN肾毒性中的作用。

该研究的发现具有多重意义。首先，它为ITSN作为一种有潜力的生物农药和抗肿瘤药物的安全评价提供了至关重要的毒理学数据，提示其在应用时需密切关注肾毒性风险，并考虑其相对较窄的治疗窗。其次，研究所采用的整合网络毒理学、计算模拟与实验验证的策略，为其他天然化合物的毒性机制研究和风险评估提供了一个可借鉴的强大框架。最后，对PI3K/AKT通路在ITSN肾毒性中关键作用的阐明，不仅加深了对该类化合物毒理机制的认识，也可能为未来开发相应的解毒或干预策略提供潜在靶点。

当然，本研究也存在一些局限性，例如尚未通过基因敲除或干扰等技术直接验证核心靶点间的因果关系，体内实验也未观察到明显的肾纤维化，这可能与给药周期较短或损伤类型有关。未来的研究可在此基础上，进一步开展慢性毒理学实验，并探索通过结构修饰或靶向递送系统以提高ITSN的安全性，扩大其治疗窗。总之，这项研究为ITSN的合理应用和风险管控奠定了坚实的科学基础，并对天然产物的毒理学研究范式做出了有益探索。