增加植物蛋白的摄入量与在高强度训练期间肠道微生物群的组成和功能变化有关

《Food Nutrition》：Increased intake of plant protein is associated with changes in composition and functionality of the gut microbiome during a period of intense training

肠道微生物组与短链脂肪酸在植物蛋白和动物蛋白干预下的变化及其与运动互作研究。

　　这项研究探讨了植物性（扁豆）和动物性（乳清蛋白与鸡蛋蛋白）饮食补充对健康成年人进行12周抗阻训练期间肠道菌群组成和粪便短链脂肪酸（SCFA）的影响。研究总共招募了24名参与者（年龄在18至35岁之间，其中11名男性和13名女性），并随机分配到三个干预组：安慰剂组（N=9）、动物蛋白组（N=7）和植物蛋白组（N=8）。参与者按照各自的干预组别每日摄入富含蛋白质的意大利面和饮料。为了分析肠道菌群和SCFA，研究人员在五个时间点收集了粪便样本。

研究发现，植物蛋白组的肠道菌群多样性得到了显著增强，并且SCFA生成菌属（如Fusicatenibacter、Faecalibacterium和Agathobacter）的丰富度也有所提高。功能性预测分析显示，植物蛋白和动物蛋白组都表现出与碳水化合物代谢和肠道屏障完整性相关的微生物通路上调，这可能与增加的运动量有关。此外，植物蛋白组的有益SCFA（尤其是丁酸和乙酸）含量显著增加。通过整合微生物组成、功能通路分析和代谢物谱，研究揭示了植物蛋白在促进肠道菌群多样性和功能方面的潜力，特别是在促进有益SCFA生成菌方面。这些发现表明，植物蛋白可能比动物源蛋白更有利于肠道健康。

在研究背景中，饮食在塑造肠道菌群方面起着核心作用，而肠道菌群又强烈影响宿主的代谢、免疫和神经健康。动物蛋白，特别是乳清蛋白，已被广泛研究其对肠道健康和运动表现的影响。乳清蛋白补充已被证明可以影响肠道菌群，增加有益菌如Bacteroidetes的丰度，同时减少潜在有害菌如Bacillota和Actinobacteria。这些菌群变化与增强代谢健康和减少炎症相关。在人体研究中，乳清蛋白补充导致肠道病毒组的改变，增加了细菌噬菌体的多样性，这可能影响微生物群落和宿主之间的相互作用。此外，将乳清蛋白与益生菌结合已被证明可以提高蛋白质吸收和运动表现。一项涉及运动员的研究显示，乳清蛋白和益生菌的结合导致循环中的支链氨基酸（BCAAs）水平升高，并显著改善了力量表现，包括腿部最大重复力量和垂直跳跃表现。

植物性饮食，特别是富含膳食纤维和多酚的饮食，与某些潜在有益的肠道微生物（如Bifidobacterium、Lactobacillus和Faecalibacterium prausnitzii）的相对增加有关，同时减少致病菌。这些微生物群在发酵不可消化碳水化合物以产生SCFA（如乙酸、丙酸和丁酸）方面发挥关键作用，这些SCFA是结肠细胞的能量来源，可以增强肠道屏障，调节炎症并维持免疫稳态。鉴于全球蛋白质需求预计到2050年将翻倍，人们对可持续且有益健康的蛋白质替代品的兴趣日益增加。植物蛋白提供了与动物蛋白相当的营养价值，同时具有较低的环境影响和额外的代谢益处，包括降低死亡率和改善心血管代谢结果。豆类（如豆类、扁豆、鹰嘴豆和豌豆）尤其引人注目，因为它们不仅提供高质量的蛋白质，还富含复杂的碳水化合物、纤维、微量营养素和具有抗氧化和抗炎潜力的多酚。它们的可溶性纤维和寡糖还作为益生元，选择性地刺激有益微生物。

身体活动是另一个影响肠道菌群的重要因素。运动已被证明可以增强微生物多样性并增加SCFA的产生，同时在某些菌群（如Faecalibacterium prausnitzii和Lachnospira）上产生有益的菌群变化，这些菌群与减少炎症和改善免疫反应有关。这些适应性表明，饮食蛋白和运动可能共同塑造肠道微生物动态及其下游健康效应。

虽然乳清蛋白在影响肠道健康和运动表现方面已有广泛研究，但关于植物蛋白对肠道菌群影响的证据仍然有限。我们的最近一项人体试验显示，在抗阻训练期间，扁豆蛋白补充与动物蛋白相比，产生了相当或更大的力量和恢复改善。因此，本研究探讨了扁豆蛋白与乳清蛋白、鸡蛋蛋白和安慰剂相比，对接受高强度抗阻训练的成年人肠道菌群组成和代谢活动的影响。这项研究通过填补植物蛋白补充在运动后肠道微生物反应中的关键空白，提供了一定的参考价值。

研究方法部分详细描述了人体干预研究（APC176）的参与者和招募过程。通过公共广告（包括社交媒体、大学电子邮件、海报和APC网站）招募了健康男性和女性，年龄在18至35岁之间。参与者根据纳入标准被随机分配到三个饮食干预组：扁豆蛋白组、动物蛋白组和安慰剂组。研究获得了伦理批准和临床试验注册，研究名称为“Effect of dietary plant protein for promotion of muscle repair and recovery after intense exercise”。在招募后，参与者被随机分配到三个干预组，共24人，其中安慰剂组9人，动物蛋白组7人，植物蛋白组8人。

食品干预包括两个每日食品——意大利面和饮料，参与者在12周内每天摄入，总共提供每天40克额外的蛋白质。意大利面由Barilla G. e R. Fratelli S.p.A（意大利帕尔马）制造，使用来自Smart Protein项目的扁豆蛋白和鸡蛋蛋白浓缩物。不同组的意大利面配方不同：植物蛋白组使用杜兰小麦粗粒、扁豆蛋白浓缩物和水；动物蛋白组使用杜兰小麦粗粒、鸡蛋清和水；安慰剂组使用杜兰小麦粗粒和水。饮料的配方也有所不同，含有0.2克甜叶菊、1克可可、2克遮盖风味、天然香草风味和天然乳制品风味，以及2克“奶油素”（仅用于乳清和安慰剂版本）。此外，饮料还包括25克扁豆蛋白浓缩物（植物蛋白组）、20克乳清蛋白浓缩物（动物蛋白组）或5克改性土豆淀粉（安慰剂组），与150毫升大米饮料和150毫升水混合。参与者被分配到三个组别：植物蛋白组在意大利面和饮料中均含有扁豆蛋白；动物蛋白组在意大利面中含有鸡蛋蛋白，饮料中含有乳清蛋白；安慰剂组的意大利面和饮料均不含蛋白质，饮料中使用土豆淀粉。

在基线时，参与者完成了健康和生活方式问卷以及经过验证的饮食频率问卷（FFQ），以评估其常规饮食摄入情况。在12周的干预期间，参与者被提供标准化的食品（意大利面和饮料），这些食品在他们日常饮食的基础上，每天额外提供40克蛋白质。为了确保依从性，参与者被要求每天摄入这些食品，并填写产品摄入日志以记录摄入情况。如果错过餐食或摄入了额外的食品，参与者需要记录下来。研究团队每周审查这些日志以监测依从性。

为了减少其他饮食因素的影响，所有干预食品都被设计为在各组之间能量相等，仅在蛋白质来源上有所不同。干预食品和饮料的完整营养成分详见表1和表2，包括能量、宏量营养素、纤维和关键微量营养素。此外，研究团队还对参与者的基线能量摄入进行了分析，以评估不同干预组的常规饮食摄入情况。

在方法部分，研究还描述了运动干预的具体内容。所有参与者都进行了恢复性训练（垂直跳跃和Biodex）和为期12周的运动干预计划。12周的运动计划包括每周进行三次锻炼，每次锻炼60分钟，涵盖上肢、下肢和核心肌肉。运动强度从第一周到第四周为3组8次，第九周到第十二周增加到3组12次。粪便样本在基线（第0周）和第3、6、9、12周收集，用于微生物和SCFA的分析。

DNA提取和16S rRNA基因测序是研究微生物组成和功能性的关键步骤。研究团队采用重复珠磨法进行DNA提取，并根据Yu和Morrison（2004）的方法进行了小修改。大约200毫克的粪便匀浆被转移到含有不同尺寸的陶瓷珠的2 mL螺口管中。样本通过珠磨仪在4000 rpm下匀浆3分钟。匀浆后，样本在70°C下孵育15分钟，然后在4°C下离心16,000 g 5分钟。上清液被收集，而沉淀物则被重新裂解。冷的醋酸铵（7.5 M）被加入到合并的上清液中，随后在冰上孵育并离心。DNA通过异丙醇沉淀，并在-20°C下储存过夜。沉淀物被70%乙醇洗涤，重新悬浮于Tris-EDTA缓冲液中，并用RNase处理。然后加入蛋白酶K和AL缓冲液（Qiagen QIAmp DNA Stool Mini Kit），并使用乙醇进一步纯化。样本按照制造商的说明通过Qiagen QIAmp旋转柱进行处理。提取的DNA在-20°C下储存，直到用于16S rRNA基因测序。

为了分析微生物功能预测，研究团队使用了PICRUSt2工具，通过ko2kegg_abundance函数推断预测的KEGG通路丰度。不同干预组之间的差异丰度通过ALDEx2进行计算，使用Benjamini-Hochberg方法确定显著性。显著的KEGG基因组（KOs）被手动注释为通路名称和类别。为了可视化，映射到相同通路的KOs通过平均丰度按样本进行聚合，并选择基于调整后的p值的每组前25个通路。

SCFA分析部分，研究团队通过气相色谱-火焰离子检测（GC-FID）技术量化了粪便中的SCFA浓度。粪便样本在五个时间点（第0周、第3周、第6周、第9周和第12周）收集，并在收集后进行处理。样本被均质化于酸化的Milli-Q水中，比例为约200-250毫克湿粪便与1毫升溶剂。均质化后的样本在4°C下以16,000 × g离心30分钟，上清液依次通过5 μm和0.22 μm滤膜过滤。270 μL的滤液与30 μL的10 mM 2-乙基丁酸内标溶液混合，用于质量控制和定量。SCFA浓度通过气相色谱-火焰离子检测（GC-FID）技术测定，遵循Lynch等人（2021）的修改版协议。混合物通过涡旋混合并离心，离心后取250 μL上清液转移至琥珀色GC小瓶中的玻璃插件中。SCFA通过Agilent GC-FID系统与Zebron ZB-FFAP毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）进行分离。氦气作为载气（1.3 mL/min），色谱柱温度从50°C逐步升至240°C。定量基于已知浓度的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的标准曲线。SCFA浓度通过比较样品峰面积与标准品的峰面积计算得出，并通过将浓度标准化为湿粪便重量的毫摩尔数来表达，以考虑样品量和水分变化的影响。

研究结果部分展示了不同干预组（安慰剂组、动物蛋白组和植物蛋白组）在肠道微生物组成和SCFA生产方面的变化。16S测序分析显示，植物蛋白组的肠道微生物群落结构在12周干预后与动物蛋白组相比表现出更高的多样性。然而，在第0周、第3周、第9周和第12周的干预组之间没有观察到显著的多样性差异。在不同时间点（第0周、第3周、第6周、第9周和第12周）内，每个干预组的多样性也没有显著变化。β多样性分析通过Bray-Curtis距离指数进行，结果显示干预组之间存在显著差异（安慰剂组与动物蛋白组、安慰剂组与植物蛋白组、动物蛋白组与植物蛋白组），但时间点之间没有显著差异。然而，β多样性随时间变得更分散，表明菌群结构的多样性增加。

在属水平上，研究发现某些核心SCFA生成菌属（如Agathobacter、Bifidobacterium、Faecalibacterium和Ruminococcus）在所有组别中都保持相对稳定。然而，某些属表现出显著的干预相关趋势。例如，Fusicatenibacter在植物蛋白组和安慰剂组中显著增加，这与其在丁酸和丙酸生成中的已知作用一致。其在植物蛋白组中的更高丰度表明其对植物来源的可发酵底物和运动的强烈反应。此外，Collinsella在植物蛋白组中比动物蛋白组显著更丰富，这可能反映了底物特异性效应，因为扁豆蛋白含有与动物来源蛋白不同的氨基酸谱。然而，之前的研究所指出Collinsella与低纤维饮食和潜在代谢失调有关，这表明其作用可能取决于上下文，需要进一步研究。在本研究中，尽管扁豆蛋白纤维含量较低，但可能含有残留的简单碳水化合物或可发酵寡糖，或者与其它饮食成分相结合，从而促进Collinsella的生长。此外，运动干预可能通过影响肠道转运和代谢进一步调节其丰度。因此，Collinsella的增加可能反映了饮食组成和生理条件之间的相互作用，而不仅仅是低纤维的直接结果。

功能性分析显示，植物蛋白组的SCFA水平在第12周时显著高于动物蛋白组，包括乙酸、丙酸和丁酸的浓度升高。这些代谢物对于维持肠道健康、调节炎症和支持系统能量平衡至关重要。相比之下，动物蛋白组的SCFA浓度较低，这可能反映了其向蛋白发酵的转变。此前的研究表明，动物性饮食（如肉类、奶制品、鸡蛋和奶酪）可能增加不太有益的代谢物如支链脂肪酸（BCFAs）和氨的产生，同时减少SCFA的产生。此外，植物蛋白组在第9周时的戊酸水平显著升高，尽管戊酸的研究较少，但它可能反映了植物性饮食相关的更广泛的发酵模式。BCFA水平在所有组别中保持稳定且较低，这可能是因为参与者保持了均衡的饮食结构。

研究结论指出，植物蛋白摄入与抗阻训练相结合，有助于有益肠道微生物的生长，增强SCFA的产生，并促进与代谢和炎症健康相关的微生物功能通路。这些效应在动物蛋白组中较为不显著，表明在考虑训练期间的肠道菌群调节时，蛋白质来源的重要性。尽管样本量较小且研究时间较短，但这些发现为植物蛋白，特别是扁豆蛋白补充，作为促进运动活跃个体肠道微生物健康的一种有利饮食策略提供了证据。