综述：基于FRET的比率型荧光探针用于酶检测：当前见解

《Current Analytical Chemistry》：FRET-based Ratiometric Fluorescent Probes for Enzyme Detection: Current Insight

本综述系统阐述了基于荧光共振能量转移（FRET）的比率型荧光探针在酶检测领域的最新进展。文章重点探讨了该类探针相较于单发射传感器的优势，即其内置参比系统可提供更高的灵敏度和准确性。同时，综述详细介绍了用于构建探针的各类材料，并通过生物传感器实例说明了其在酶检测中的具体应用，为开发高性能荧光传感平台提供了重要参考。

　　

Abstract

在过去的十年中，多种类型的荧光传感器被开发用于检测各种分析物。利用荧光现象开发的传感器对其目标分析物具有高灵敏度和高选择性。这导致针对生物标志物的传感器开发大幅增加，这些标志物对于危及生命的疾病的早期检测或诊断尤为重要。除了荧光分析法的优势外，持续的研究致力于创建易于构建、重现性好、成本和时间效益高，同时保持足够灵敏度以准确定位目标分析物的传感器。随着研究的进展，用作简单传感器的染料被其他分子取代，作为生物标志物或其他分析物传感的底物。此外，早期的科学家使用单发射传感器检测分析物。随后，单发射传感器发展为双发射传感器，进一步的进步催生了比率型传感器的创新。这些比率型传感器提供了良好的内标参比系统，使其与其他发光传感器相比具有更好的灵敏度。通过本综述，我们旨在提供有关FRET（荧光共振能量转移）、比率荧光分析、用于开发传感器的材料类型以及用于酶检测的生物传感器实例的有用信息。

Keywords: Fluorescence spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer, ratiometric fluorescent probes, biosensors, enzyme detection, FRET-based Ratiometric Fluorescent Probes, ratiometric fluorescence analysis.

引言：从单发射到比率型传感的演进

荧光传感技术因其卓越的灵敏度与选择性，已成为生命科学和医学诊断领域不可或缺的工具。早期开发的传感器多依赖于单一荧光信号的强度变化进行检测，即单发射传感器。然而，此类传感器的信号易受环境因素（如探针浓度、pH值、温度）以及仪器波动的影响，导致检测结果可靠性受限。为解决这一问题，科研人员将目光投向了具有内部校准功能的双发射传感器，并最终推动了比率型荧光探针的诞生与发展。

比率型荧光探针的优势与FRET原理

比率型荧光探针的核心优势在于其内置的参比系统。通过测量两个不同波长下的荧光强度比值，而非单一波长的绝对强度，可以有效抵消上述环境与仪器变量的干扰，从而显著提高检测的准确性和重现性。在众多构建比率型探针的策略中，基于荧光共振能量转移（FRET）的设计尤为突出。FRET是一种非辐射能量转移过程，当供体荧光团的发射光谱与受体荧光团的吸收光谱发生重叠，且两者距离足够近（通常为1-10 nm）时，能量从供体向受体转移，导致供体荧光猝灭而受体荧光增强。通过监测供体与受体荧光强度的比值变化，即可实现对目标分析物的高精度定量检测。

用于构建FRET探针的材料类型

构建高效的FRET比率型探针依赖于精心选择的材料对。早期研究主要使用有机小分子染料作为供体和受体。随着纳米技术的发展，量子点（QDs）、上转换纳米粒子（UCNPs）、碳点（CDs）以及金属纳米簇等纳米材料被广泛引入FRET体系。这些纳米材料通常具有摩尔吸光系数高、荧光量子产率高、光稳定性好以及尺寸和光谱可调等优点，为设计性能更优越的探针提供了广阔平台。此外，一些生物大分子，如荧光蛋白（FPs），也常被用作FRET对，特别是在活细胞成像应用中。

酶检测生物传感器实例

酶是关键的生物标志物，其活性异常与多种疾病（如癌症、神经退行性疾病、炎症）密切相关。FRET比率型探针在酶活性检测中展现出巨大潜力。其设计策略通常是将酶特异性识别的底物序列（如多肽、寡核苷酸）连接在FRET供体-受体对之间。当目标酶不存在时，探针保持完整，FRET效率高，表现出特定的荧光比值。一旦酶存在并水解其特异性底物，连接臂被切断，供体与受体分离，FRET过程被中断，从而导致荧光比值发生显著变化。例如，针对 caspase 蛋白酶（与细胞凋亡相关）、基质金属蛋白酶（MMPs，与肿瘤侵袭转移相关）以及各种激酶/磷酸酶（与信号转导相关）的高选择性FRET比率型探针已被成功开发，并应用于体外检测和活体成像研究。

结论与展望

基于FRET的比率型荧光探针为酶检测提供了强大而可靠的工具。其内置校准能力克服了传统单发射传感器的局限性，在复杂生物环境中实现了更准确、更稳定的检测。未来研究将集中于开发新型、生物相容性更好的荧光材料，优化探针的靶向递送效率，以及构建能够同时检测多种酶活性的多功能探针系统，从而在基础生物学研究和临床诊断中发挥更大作用。