中强度脉冲电场（MI-PEF）处理显著提升明串珠菌右旋糖酐产量的机制与应用前景

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Boosting microbial dextran production through moderate-intensity pulsed electric field (MI-PEF) treatments

本研究针对传统发酵法生产右旋糖酐产量不足的瓶颈，创新性地采用中强度脉冲电场（MI-PEF）预处理明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）菌种。结果表明，MI-PEF在保持细胞活性的前提下，可诱导亚致死应激，使右旋糖酐产量提升七倍以上（达40.19 g/L），且产物结构性质未发生改变。该技术为高效、节能地满足工业对微生物胞外多糖（EPS）的需求提供了新策略。

　　

在食品和制药工业中，有一类由微生物产生的“明星”材料——胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）。其中，由明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）产生的右旋糖酐（Dextran）尤为突出。这种由葡萄糖单元构成的多糖，凭借其出色的增稠、稳定、保湿乃至抗氧化、抗菌等特性，被广泛应用于酸奶、沙拉酱等食品中作为质构改良剂，以及在医药领域作为血浆代用品和药物载体。然而，一个长期存在的瓶颈限制了其更广泛的应用：通过传统发酵方法，明串珠菌产生的右旋糖酐产量通常徘徊在每升几克到十几克的水平，远远无法满足巨大的工业需求。传统的增产策略，如优化培养基配方和发酵参数，往往过程繁琐、耗时且成本高昂。因此，开发一种能够高效、节能地提升右旋糖酐产量的新技术，成为了该领域的研究热点。

近期，非热加工技术显示出通过诱导微生物亚致死应激来刺激其代谢、从而提高目标产物产量的潜力。在众多技术中，脉冲电场（Pulsed Electric Field, PEF）技术尤为引人注目。其原理是利用短暂的高压脉冲（微秒到毫秒级）作用于细胞，使细胞膜发生可逆的电穿孔（即膜通透性暂时增加），从而影响细胞的物质运输和代谢活动。当采用高强度PEF（HI-PEF）时，会造成细胞膜不可逆的损伤，常用于杀菌。而中强度PEF（Moderate-Intensity PEF, MI-PEF，电场强度通常低于10 kV/cm）则能引起可逆的电穿孔，在不杀死细胞的前提下，可能“激活”细胞的应激反应，改变其代谢途径。此前虽有零星研究探讨PEF对乳酸菌产EPS的影响，但针对高产右旋糖酐的明串珠菌，以及MI-PEF处理对其代谢的精细调控机制，尚属空白。

为了解决上述问题，意大利乌迪内大学的研究团队在《Innovative Food Science》上发表了一项创新性研究，系统探讨了MI-PEF预处理对明串珠菌DSA_O菌株右旋糖酐产量的影响及其潜在机制。

为开展本研究，研究人员主要应用了几项关键技术方法：首先，确定了明串珠菌DSA_O的对数生长中期作为MI-PEF处理的最佳生理状态。其次，设计并实施了六种不同参数（频率和脉冲数）的MI-PEF处理方案。第三，通过菌落形态分析、生长动力学曲线拟合以及细胞活性测定，评估了MI-PEF的亚致死效应。第四，利用场发射扫描电子显微镜（FEG-SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察了MI-PEF处理前后细胞的表面形貌和胞外多糖分布变化。第五，通过重力法定量分析了右旋糖酐的产量，并采用核磁共振（NMR）技术，包括一维、二维谱和扩散排序谱（DOSY），对产物的化学结构和分子量进行了表征。

3.1. MI-PEF对微生物存活率以及在液体和固体培养基中生长的影响

研究人员首先精确确定了明串珠菌DSA_O在对数生长中期的培养时间点（18小时），以确保处理时细胞处于代谢活跃状态。随后，他们应用了六种不同强度的MI-PEF处理（T1-T6）。结果显示，所有处理均未显著降低细胞的存活率，表明MI-PEF处理是非致死性的。然而，在固体培养基上，经MI-PEF处理的细菌形成的菌落直径显著小于对照组。这种“菌落变小”的现象是细胞遭受亚致死损伤的典型标志，暗示其代谢活动可能发生了改变。有趣的是，在液体培养基中，处理组与对照组的生长动力学参数（如延滞期λ、最大生长速率μ_max）并无显著差异。这种差异可能是因为液体环境中营养充足，细胞更容易修复轻微损伤，而固体培养基上资源有限，亚致死损伤的影响更易显现。这一发现确认了MI-PEF成功诱导了明串珠菌的亚致死应激，为后续观察到的代谢改变奠定了基础。

3.2. MI-PEF处理对EPS产量的影响

这是本研究最核心的发现。MI-PEF处理对右旋糖酐产量产生了极其显著的提升效果。即使在最温和的处理条件（T1）下，产量也从对照组的5.96 g/L跃升至25.34 g/L。而最强的处理（T6）更是将产量提升至40.19 g/L，比对照组高出七倍多，且处理过程中的温升可以忽略，证实了这是PEF的非热效应。进一步分析发现，右旋糖酐产量与MI-PEF处理中输入样品的特定能量密度（W_T）呈强烈的正相关关系。特别值得注意的是，在较低的频率（250 Hz）下，能量密度对产量的提升效率（回归直线斜率）更高，提示低频MI-PEF可能对细胞膜具有更有效的透化作用。为了确保增产不牺牲产品质量，研究人员通过核磁共振（NMR）技术对MI-PEF处理下产生的右旋糖酐进行了详细表征。结果表明，其化学结构（主要为α-(1→6)糖苷键连接，伴有约3%的分支度）和分子量均与对照组产品无异，这意味着MI-PEF在大幅提升产量的同时，完好地保留了右旋糖酐既有的功能和技术特性。

3.3. SEM和CLSM观察

为了深入理解MI-PEF提升产量的机制，研究人员借助显微镜技术观察了细胞表面的变化。扫描电镜（SEM）图像显示，未经处理的对照组细胞表面光滑、形态完整。而经MI-PEF（T6）处理后，细胞表面变得粗糙，并出现了类似水泡状的结构。这种形貌改变很可能是MI-PEF引起细胞膜（细胞包膜的主要组成部分）可逆性电穿孔和结构重塑的直接证据。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的观察结果提供了更有力的支持。研究人员使用能与葡萄糖和甘露糖特异性结合的Alexa Fluor 488标记的伴刀豆球蛋白A（ConA）对细胞进行染色。结果显示，MI-PEF处理后的细胞发出了远比对照组强烈的绿色荧光。这强烈表明，要么是细胞表面积累了更多的右旋糖酐（其主要成分为葡萄糖），要么是MI-PEF处理导致细胞包膜结构改变，使得原本被掩盖的糖缀合物暴露了出来。这两种可能性都指向MI-PEF处理显著改变了细胞与胞外多糖相关的表面特性。

结论与讨论

本研究首次证实，对处于对数生长期的明串珠菌DSA_O菌株进行MI-PEF预处理，是一种极具潜力的、能够大幅提升右旋糖酐产量的策略。MI-PEF处理诱导了明确的亚致死应激（表现为菌落尺寸减小），但并未影响细胞在液体中的整体生长能力。产量提升与处理能量密度呈正相关，且在低频下效率更高。显微镜观察揭示了MI-PEF引起了显著的细胞表面结构改变和胞外多糖积累的增加。至关重要的是，产品的关键质量属性（化学结构和分子量）得以保持。

其重要意义在于：研究者提出，MI-PEF可能通过两种主要机制起作用。其一，可逆的电穿孔增加了细胞膜的通透性，这可能有利于蔗糖（合成右旋糖酐的底物）更高效地运输到细胞表面或外部环境，从而被右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase）利用。其二，亚致死应激本身可能作为一种信号，直接激活了细胞合成右旋糖酐以进行自我保护的代谢途径。SEM观察到的表面粗糙化和CLSM显示的碳水化合物信号增强，共同支持了这些机制。与需要昂贵设备和可能造成不可逆损伤的高静水压（HHP）或可能引起局部剧烈变化的超声波（US）等技术相比，MI-PEF显示出可调、节能、温和且易于放大的优势。

综上所述，该研究不仅为解决工业级微生物多糖生产中的低产难题提供了一种创新、高效且具有良好应用前景的物理调控方法，而且深化了我们对MI-PEF这一非热技术调控微生物代谢机制的理解。未来研究可进一步探索该技术在其他产EPS菌株上的普适性，并优化工艺参数以实现大规模生产，为可持续生物制造开辟新的途径。