通过生理学和蛋白质组学方法研究香草醛与益生菌乳酸菌Lacticaseibacillus rhamnosus GG之间的新兴共生相互作用

《ACS Food Science & Technology》：Emerging Synbiotic Interactions between Vanillin and the Probiotic Bacterium Lacticaseibacillus rhamnosus GG Determined via Physiological and Proteomic Approaches

本研究探究了香草醛对益生菌LGG的促生长作用及其蛋白组学变化，发现香草醛增强LGG自动凝聚及与大肠杆菌共凝聚能力，但未提升抗氧化活性，并导致cytidylate kinase表达下调，提示其可能作为前体优化共生组合效果。

　　本研究聚焦于一种广泛应用的食品添加剂——香兰素（vanillin）对乳酸乳球菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG，简称LGG）这种益生菌的影响。LGG作为一种被广泛研究的益生菌，因其在肠道菌群平衡、免疫调节以及抗氧化等方面的积极作用而备受关注。香兰素是一种天然存在的酚类化合物，常用于食品、饮料、化妆品和药品中，不仅因其独特的风味，还因其具有抗氧化、抗菌和抗癌等生物活性。研究发现，香兰素与益生菌在肠道中的相互作用可能增强益生菌的功能，因此，本研究通过体外实验和蛋白质组学方法，探讨香兰素对LGG的生长、聚集能力以及分泌蛋白的影响，从而评估其作为益生元的潜力。

### 1. 益生菌与香兰素的背景

益生菌是指在适当剂量下能够对宿主健康产生益处的活微生物，它们通常定植于肠道，并通过多种机制调节宿主的生理状态。例如，益生菌可以通过促进肠道菌群的多样性、增强免疫系统、抑制有害细菌的生长、调节肠道屏障功能等方式，对宿主的健康产生积极影响。其中，LGG因其较强的耐受性、黏附能力以及抗氧化特性，被认为是益生菌研究中最具代表性的菌株之一。LGG不仅能够抵抗胃酸和胆盐，还能在肠道中形成稳定的菌群，进而发挥免疫调节作用。

香兰素是一种广泛存在于自然界中的酚类化合物，主要来源于香荚兰豆（Vanilla planifolia）。作为一种天然产物，香兰素在食品工业中被广泛使用，特别是在烘焙、乳制品和饮料领域。除了其作为调味剂的功能外，香兰素还具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌作用。这些特性使其成为一种具有潜在健康价值的天然成分，同时也引发了对其作为益生元或益生菌协同作用（synbiotic）的研究兴趣。

在肠道中，益生菌和益生元的协同作用可以增强益生菌的功能，提高其在肠道中的存活率和活性。香兰素作为一种酚类化合物，可能通过改变益生菌的代谢活动或分泌蛋白的表达，间接影响其对宿主的益处。因此，本研究旨在通过体外实验和蛋白质组学分析，探讨香兰素对LGG的影响，尤其是其对菌株聚集能力和分泌蛋白的调节作用。

### 2. 实验方法与流程

本研究采用了一系列实验方法，包括微生物生长监测、聚集能力评估、抗氧化活性测试以及蛋白质组学分析，以全面评估香兰素对LGG的作用。

#### 2.1 微生物生长实验

LGG在体外条件下被培养于一种半合成的乳酸菌培养基（LABSEM）中，培养温度设定为37℃，且不进行摇晃。为了观察香兰素对LGG生长的影响，实验组分别添加了不同浓度的香兰素（0–200 μg/mL），并监测其生长曲线。结果显示，香兰素并未抑制LGG的生长，反而可能为其提供了一个更适合的生长环境。这表明香兰素可能在某些条件下促进益生菌的增殖，而非直接发挥抗菌作用。

#### 2.2 聚集能力实验

聚集能力是益生菌在肠道中定植和发挥功能的重要指标。本研究通过自聚集（autoaggregation）和共聚集（coaggregation）实验，评估了香兰素对LGG聚集行为的影响。自聚集是指同一菌株的细菌相互聚集的能力，而共聚集则是指益生菌与不同种类细菌（如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）之间的相互结合能力。实验中，LGG在香兰素存在的情况下，其自聚集能力显著增强，尤其是在200 μg/mL浓度下。此外，香兰素还增强了LGG与大肠杆菌的共聚集能力，但对与金黄色葡萄球菌的共聚集能力影响较小。这表明香兰素可能在某些条件下促进益生菌与特定病原菌的结合，从而增强其对抗病原菌的能力。

#### 2.3 抗氧化活性测试

抗氧化活性是益生菌的重要生理特性之一，能够帮助宿主抵抗氧化应激，维持体内红ox平衡。本研究通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS（2,2′-联氮-双-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)）两种自由基清除实验，评估了香兰素对LGG抗氧化能力的影响。结果显示，香兰素并未显著增强LGG对这两种自由基的清除能力，这可能与其在实验中所采用的反应时间有关。然而，LGG本身具有一定的抗氧化活性，其分泌的抗氧化物质能够中和自由基，保护细胞免受氧化损伤。

#### 2.4 蛋白质组学分析

为了进一步了解香兰素对LGG分泌蛋白的影响，本研究采用了二维凝胶电泳（2-DE）和质谱分析（LC-MS/MS）相结合的方法。通过将LGG在香兰素存在和不存在的条件下培养，提取其分泌蛋白，并进行比较分析。实验发现，香兰素导致某些分泌蛋白的表达量显著降低，其中最显著的是一个编码为cmk的胞苷酸激酶（cytidylate kinase），其表达量减少了1.6倍，并且具有统计学意义（p = 0.0052）。此外，另一个位于同一蛋白点的未知蛋白（LRHM_1831）也表现出类似的表达变化。这些结果表明，香兰素可能通过影响LGG的代谢活动和细胞膜稳定性，间接改变其分泌蛋白的表达模式。

### 3. 实验结果与讨论

#### 3.1 香兰素对LGG生长的影响

香兰素作为一种天然的酚类化合物，已被广泛研究其对多种细菌的影响。研究表明，香兰素能够抑制某些革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的基因表达，特别是与外排泵相关的基因，从而影响其抗生素耐受性。然而，本研究发现，香兰素并未对LGG的生长产生抑制作用，反而可能促进其增殖。这表明香兰素对LGG具有选择性的影响，可能在某些条件下为其提供生长优势，而非直接抗菌。

#### 3.2 香兰素对LGG聚集能力的影响

聚集能力是益生菌在肠道中定植和发挥功能的关键因素之一。LGG的自聚集能力在香兰素存在的情况下显著增强，尤其是在200 μg/mL浓度下。这可能与香兰素对LGG细胞膜结构或细胞表面蛋白的调节有关。此外，香兰素还增强了LGG与大肠杆菌的共聚集能力，但对其与金黄色葡萄球菌的共聚集能力影响较小。这种选择性增强的共聚集能力可能有助于LGG在肠道中形成稳定的菌群，并通过抑制病原菌的生长来增强其对宿主的保护作用。

#### 3.3 香兰素对LGG抗氧化能力的影响

尽管香兰素具有较强的抗氧化活性，但本研究发现，它并未显著增强LGG对DPPH和ABTS自由基的清除能力。这可能与实验条件有关，例如反应时间、香兰素的浓度以及LGG的培养方式。然而，LGG本身具有一定的抗氧化能力，其分泌的抗氧化物质能够中和自由基，保护宿主细胞免受氧化损伤。因此，香兰素可能在某些条件下通过间接方式增强LGG的抗氧化功能，例如通过改变其代谢活动或促进其分泌某些抗氧化蛋白。

#### 3.4 香兰素对LGG分泌蛋白的影响

蛋白质组学分析显示，香兰素显著改变了LGG的分泌蛋白表达模式。其中，编码为cmk的胞苷酸激酶的表达量减少了1.6倍，这一变化具有统计学意义。胞苷酸激酶在核苷酸代谢中起着关键作用，能够将胞苷单磷酸（CMP）转化为胞苷二磷酸（CDP），后者是磷脂合成的前体，对细胞膜的稳定性和功能至关重要。此外，胞苷酸激酶的表达还受到酸性和高盐等应激条件的影响，这表明香兰素可能通过影响LGG的代谢途径，间接影响其细胞膜的稳定性。

另一个在相同蛋白点中被鉴定的未知蛋白（LRHM_1831）可能与细胞膜或细胞外基质的相互作用有关。其表达量的减少可能意味着LGG在香兰素存在的情况下，其与环境的互动能力受到一定影响。这可能包括对宿主细胞的黏附能力、与其他微生物的共聚集能力，以及对环境信号的感知能力。这些变化可能对LGG在肠道中的功能产生影响，例如降低其对病原菌的抑制能力或改变其对宿主免疫系统的调节方式。

### 4. 结论

本研究通过一系列体外实验和蛋白质组学分析，揭示了香兰素对LGG的多方面影响。首先，香兰素并未抑制LGG的生长，反而可能为其提供一个更适合的生长环境。其次，香兰素显著增强了LGG的自聚集能力和与大肠杆菌的共聚集能力，这可能有助于其在肠道中形成稳定的菌群，并通过抑制病原菌的生长来增强其对宿主的保护作用。此外，香兰素对LGG的抗氧化能力影响较小，但其对分泌蛋白的调节作用可能间接影响LGG的生理功能。

值得注意的是，香兰素对LGG分泌蛋白的影响主要体现在某些关键蛋白的表达量降低，例如胞苷酸激酶（cmk）和一个未知蛋白（LRHM_1831）。这些蛋白的减少可能与LGG的代谢活动、细胞膜稳定性以及环境适应能力有关。尽管香兰素并未显著增强LGG的抗氧化活性，但其对聚集能力的促进作用可能使其在肠道中更具竞争优势，从而增强其作为益生菌的益处。

综上所述，香兰素作为一种天然的酚类化合物，可能通过影响LGG的代谢和分泌蛋白表达，间接增强其对宿主的益处。然而，其作为益生元的潜力仍需进一步研究，特别是在体内条件下的验证。此外，本研究还发现，香兰素对LGG的影响具有一定的选择性，可能在某些条件下促进其生长和功能，而在其他条件下则可能抑制其某些关键生理活动。这些发现为未来开发基于香兰素和LGG的益生元组合提供了理论依据，同时也为理解香兰素在肠道中的作用机制提供了新的视角。