鉴定两栖动物中的新型DNA加合物，并利用分散固相萃取技术开发加合物组学的样品制备方法

《Environmental Science & Technology》：Identifying Novel DNA Adducts in Amphipods and Developing Sample Preparation for Adductomics Using Dispersive Solid-Phase Extraction

环境DNA加合物分析中，采用分散固相萃取（d-SPE）结合高分辨率质谱（LC–HRMS）及nLossFinder软件和GitLab数据库，成功鉴定了等足目动物Monoporiea affinis的16种新型DNA加合物，并显著提升检测灵敏度（最高达170%）。d-SPE通过吸附磷脂、蛋白质等基质干扰，减少色谱信号抑制，同时保留DNA完整性，为环境污染物暴露评估提供高效工具。

　　随着环境DNA加合物组学（adductomics）在暴露评估中的应用日益广泛，对于改进适用于化学和生物多样性样品的方法提出了更高的需求。当前，液相色谱与高分辨率质谱（LC–HRMS）技术已显著提升了DNA加合物组的分析能力，但在非哺乳动物模型中，样品净化方法仍面临诸多挑战。为应对这些挑战，本研究以一种生活在波罗的海的指示物种——*Monoporiea affinis*（单孔虫）作为实验模型，旨在开发适用于甲壳类动物的加合物分析方法。这种小体型的底栖甲壳类动物因其坚硬的几丁质组织和较高的脂质含量，成为分析DNA加合物的困难样本，因此其在生物效应研究中的使用具有重要意义。

本研究的两个主要目标是：首先，通过结合多种工具进行DNA加合物筛查，提出可能的加合物结构；其次，评估分散固相萃取（d-SPE）作为一种样品净化步骤在DNA加合物组分析中的适用性。在第一项工作中，我们采用了一个开源软件nLossFinder与最近发布的DNA加合物数据库（GitLab）相结合，以提高未知加合物的结构识别能力。这种组合利用准确的质谱数据与二级碎片离子（MS2）的碎片化过程，成功区分了复杂的核苷加合物混合物，并鉴定了16种DNA加合物，其中10种是首次在该物种中被报道。

在第二项工作中，我们引入了d-SPE作为一种新颖的净化方法，专门用于整个身体甲壳类样本的DNA加合物分析。使用Z-sep+作为d-SPE的吸附剂，我们发现其显著减少了基质干扰，如磷脂，并提高了DNA加合物的检测灵敏度，使得LC–HRMS信号响应提高了高达170%。相比传统的固相萃取（SPE）和液液萃取方法，d-SPE提供了更简便、更环保且更高效的净化方案，适用于高通量分析，特别是在处理大量样本时具有明显优势。未来的研究应进一步验证该方法在其他物种和DNA修饰中的适用性，从而推动环境DNA加合物组学的发展。

在样品处理方面，本研究采用Chelex-100树脂进行DNA提取，该方法在保持DNA完整性的同时，能够有效去除细胞碎片和杂质。随后，使用Z-sep+进行d-SPE净化，通过与基质成分的相互作用，显著降低了干扰物质的含量，从而提高了LC–HRMS的检测灵敏度。净化后的DNA样品表现出更高的纯度和更少的背景信号，这有助于更准确地识别DNA加合物，并减少手动处理的时间和复杂性。

为了进一步提高加合物的检测效果，我们采用了一系列酶解步骤，包括核糖核酸酶P1（NP1）、磷二酯酶I（SVPDE）和碱性磷酸酶（AKP）。这些酶的使用有助于将DNA分解为单核苷酸，并通过去除未修饰的核苷酸，提高加合物的富集效率。LC–HRMS分析显示，经过d-SPE净化后，大多数DNA加合物的信号强度显著提高，从而提高了检测的准确性和灵敏度。值得注意的是，尽管部分核苷（如dI和dU）的信号强度有所下降，但总体上，d-SPE显著增强了DNA加合物的检测能力。

此外，d-SPE的应用时间也对结果产生了重要影响。在DNA消化前应用d-SPE能够有效去除基质干扰物质，如磷脂、蛋白质和脂肪，从而减少这些物质对LC–MS信号的抑制。相反，若在DNA消化后应用d-SPE，则可能导致加合物的信号强度显著降低，因为这些加合物可能直接与Z-sep+中的锆离子发生配位作用，从而被吸附。因此，d-SPE应在DNA提取后、消化前尽早应用，以确保最佳的净化效果。

本研究的发现表明，d-SPE不仅能够有效减少基质干扰，还能提高DNA加合物的检测一致性，这对于环境监测和生物效应评估至关重要。通过多变量分析，我们发现d-SPE显著降低了个体间的变异，使得同一批样本的加合物谱更加一致。这种一致性有助于建立准确的暴露阈值，并支持跨物种的比较研究。同时，我们提出了一种整合d-SPE净化步骤的标准化工作流程，适用于多种非模式生物，如几丁质含量高的无脊椎动物，这些生物在环境监测中具有广泛的适用性。

在数据分析方面，我们利用nLossFinder和GitLab数据库，对LC–HRMS数据进行了非靶向分析。nLossFinder基于脱氧核糖的中性丢失特征（116.0474 Da），实现了无需预先知道加合物结构的非靶向检测。结合GitLab数据库中的结构信息，我们能够对检测到的加合物进行更准确的分类和特征描述。尽管部分加合物的结构尚未完全确认，但基于高分辨率质谱数据的匹配，我们提出了多个可能的加合物结构，并发现这些加合物可能来源于氧化应激、脂质过氧化、反应性氮物种（RNS）或烷基化作用等环境过程。

本研究还探讨了DNA加合物的潜在来源。部分加合物可能源于细胞内氧化应激产生的活性氧（ROS）和脂质过氧化产物，这些物质可能通过共价结合与DNA相互作用。此外，某些加合物可能由烷基化剂（如苯并[a]芘的二醇表型代谢产物）引发，而另一些则可能由DNA甲基化过程形成。通过分析加合物的结构特征，我们推测这些加合物可能与特定的环境暴露相关，并为未来的暴露与生物效应关系研究提供了基础。

为了确保数据分析的可靠性，我们采用了非参数Wilcoxon检验和置换多元方差分析（PERMANOVA）来评估d-SPE对DNA加合物水平的影响。结果显示，d-SPE显著提高了大多数加合物的响应信号，并且在标准化数据中，这种提升更加明显。这些数据表明，d-SPE不仅提高了检测的灵敏度，还增强了数据的一致性，从而提升了环境DNA加合物组学的可比性和实用性。

在讨论部分，我们进一步探讨了d-SPE在环境监测中的应用潜力。由于d-SPE的高效性和简便性，它能够适用于多种非模式生物的加合物分析，尤其是那些具有复杂基质的物种。此外，我们还提出，未来的研究应结合LC–UV技术进行dG的定量分析，以建立更可靠的标准化框架。这种结合将有助于减少基质效应的影响，并提高不同样本和研究之间的可比性。

总的来说，本研究通过引入d-SPE作为样品净化步骤，显著提升了DNA加合物的检测能力和数据一致性。这不仅为环境监测提供了新的工具，也为理解环境暴露与生物效应之间的关系奠定了基础。随着对非模式生物DNA加合物组学研究的深入，d-SPE的应用有望进一步推动环境毒理学和生态毒理学的发展，为评估和管理环境污染物的生态风险提供更全面的科学依据。