胶质母细胞瘤中miR-92b链选择失衡通过表观遗传调控COL7A1介导替莫唑胺耐药的新机制

《Cellular & Molecular Biology Letters》：MicroRNA strand ratio disarray promotes temozolomide resistance in glioblastoma

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)替莫唑胺(TMZ)耐药难题，揭示了microRNA链选择失调的关键作用。研究人员发现TUT4介导的miR-92b-3p/-5p比例失衡通过表观遗传调控COL7A1表达，促进胶原沉积和TMZ耐药。该研究不仅阐明了TMZ耐药的新机制，还发现金硫葡萄糖(ATG-H)可通过调控miRNA链选择恢复TMZ敏感性，为克服GBM化疗耐药提供了新策略。

　　

胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)作为成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤，其治疗一直是神经肿瘤领域的重大挑战。尽管替莫唑胺(Temozolomide, TMZ)已成为GBM的标准化疗药物，但耐药性的出现严重限制了其疗效，导致患者预后极差，中位生存期仅14.6个月。无论是先天耐药还是获得性耐药，都成为临床治疗的主要障碍，因此探索TMZ耐药机制并寻找新的治疗靶点迫在眉睫。

在微观层面，microRNA(miRNA)的调控网络日益受到关注。有趣的是，来自同一前体的miRNA两条链(3p和5p)往往表现出不同的功能特性，这种"链选择"现象在不同组织和疾病状态下存在差异。然而，miRNA链选择在GBM TMZ耐药中的作用尚未被深入研究。发表在《Cellular & Molecular Biology Letters》上的这项研究，由沈芳芳和吴鹏飞等研究人员完成，首次揭示了miR-92b链选择失衡在TMZ耐药中的关键作用及其分子机制。

研究人员发现，在TMZ耐药的GBM细胞中，miR-92b-3p表达上调而miR-92b-5p表达下调，这种比例失衡与TMZ耐药密切相关。机制上，miR-92b-3p通过靶向HDAC9(组蛋白去乙酰化酶9)，而miR-92b-5p通过调控FOXP3(叉头框蛋白P3)，共同导致H3K27ac(组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化)水平升高，进而促进COL7A1(胶原蛋白VII型α1链)转录和胶原沉积，最终诱导TMZ耐药。更重要的是，研究还发现TUT4(末端尿苷酰转移酶4)通过尿苷化修饰pre-miR-92b调控链选择，而TUT4抑制剂ATG-H能够逆转这一过程，恢复TMZ敏感性。

关键技术方法

本研究整合了生物信息学分析和实验验证：利用GEO、CGGA和CPTAC数据库进行差异表达分析；通过体外细胞模型(LN229、U251、HG7及其TMZ耐药株)进行功能验证；采用荧光原位杂交(FISH)检测miRNA表达定位；通过荧光素酶报告实验、RNA pull-down验证miRNA与靶基因互作；利用染色质免疫沉淀(ChIP)分析组蛋白修饰；建立小鼠原位移植瘤模型进行体内验证；使用免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)分析蛋白表达；通过皮 Sirius红和Masson染色评估胶原沉积。

研究结果

miR-92b在亲代和TMZ耐药GBM细胞中呈现差异链选择

研究人员通过分析GEO数据集(GSE100775)发现，六对miRNA在敏感和TMZ耐药GBM细胞中表现出差异链选择，其中miR-92b的3p/5p比率在两组细胞中呈现明显倒置。在TMZ耐药的GBM细胞(229R、HG7R和251R)中，miR-92b-3p表达升高而miR-92b-5p表达降低，这一趋势在复发性GBM样本中得到验证。

荧光原位杂交(FISH)分析进一步证实了miR-92b-3p在TMZ耐药GBM细胞和复发性GBM样本中表达增加，而miR-92b-5p在亲代GBM细胞和原发性GBM样本中表达较高。临床预后分析显示，基于miR-92b-3p/-5p表达模式的风险评分与接受TMZ化疗的GBM患者生存显著相关，低风险评分患者从TMZ化疗中获益更多。

miR-92b-3p/-5p以相反效应介导TMZ耐药

为了探究miR-92b-3p/-5p在TMZ耐药中的功能，研究人员建立了原位小鼠模型，分别敲低miR-92b-3p或过表达miR-92b-5p的TMZ耐药细胞(229R)进行体内实验。结果显示，miR-92b-3p敲低或miR-92b-5p过表达显著延长了TMZ治疗小鼠的生存期，并抑制了肿瘤生长。

体外实验进一步证实，miR-92b-3p促进GBM细胞增殖和活力，抑制凋亡，减少DNA损伤，从而增强TMZ耐药性；而miR-92b-5p则发挥相反作用，抑制细胞增殖，促进凋亡，增加DNA损伤，抑制TMZ耐药。

miR-92b-3p/-5p比率升高促进细胞内乙酰化水平

基因本体(GO)分析显示，miR-92b-3p靶基因主要富集于去乙酰化相关通路，而miR-92b-5p靶基因与乙酰化相关通路相关，提示miR-92b-3p/-5p比率升高可能促进细胞内乙酰化水平。实验证实TMZ耐药GBM细胞中总蛋白乙酰化活性增加，乙酰辅酶A(acetyl-CoA)和乙酰肉碱(acetyl-carnitine)水平升高。

Western blot分析显示，较高的miR-92b-3p和较低的miR-92b-5p水平增加了H3K9ac、H3K27ac、H4K5ac和H4K12ac的乙酰化，其中H3K27ac增加尤为显著。DAPI核染色表明，miR-92b-3p/-5p比率升高促进了核扩张，表明染色质结构更加松散。

miR-92b-3p通过靶向HDAC9提高H3K27ac水平

通过整合GEO数据库(GSE113510和GSE100736)和细胞样本分析，研究人员发现HDAC9在TMZ耐药GBM细胞中表达显著降低，且其3'UTR含有miR-92b-3p潜在结合位点。RNA pull-down实验证实miR-92b-3p与HDAC9直接结合，荧光素酶报告实验进一步验证了miR-92b-3p直接靶向HDAC9 3'UTR区域。

功能实验表明，miR-92b-3p通过靶向HDAC9提高H3K27ac水平，而HDAC9过表达可减弱miR-92b-3p模拟物对H3K27ac的促进作用。

miR-92b-5p通过靶向FOXP3降低H3K27ac水平

研究人员发现FOXP3与miR-92b-5p调控的乙酰化通路密切相关，且在TMZ耐药GBM细胞和WHO IV级胶质瘤中显著上调。FOXP3通过置换HDAC2和HDAC4增强组蛋白乙酰化，其3'UTR含有miR-92b-5p结合位点。

实验证实miR-92b-5p直接靶向FOXP3，低表达的miR-92b-5p通过减轻对FOXP3的靶向作用，提高了TMZ耐药GBM细胞中的H3K27ac水平。

miR-92b-3p/-5p比率升高促进H3K27ac在COL7A1启动子区域的富集

GO富集分析显示HDAC9和FOXP3与细胞外基质(ECM)重塑相关。实验证实复发性GBM样本和TMZ耐药小鼠中胶原沉积显著增加。研究人员通过整合分析确定了COL7A1作为关键的胶原相关基因，在TMZ耐药GBM细胞中表达上调。

ChIP-PCR分析显示，TMZ耐药细胞中H3K27ac在COL7A1启动子区域的富集显著增加。机制上，miR-92b-3p/-5p比率升高通过沉默HDAC9和减轻FOXP3靶向，提高了COL7A1启动子区域的H3K27ac富集，从而促进COL7A1表达和胶原沉积。

ATG-H抑制TUT4介导的链选择并恢复TMZ敏感性

研究发现TUT4在TMZ耐药GBM细胞中表达上调，通过尿苷化pre-miR-92b促进miR-92b-3p的优先选择。TUT4抑制剂金硫葡萄糖(ATG-H)能够显著降低miR-92b-3p表达同时提高miR-92b-5p表达。

体内外实验表明，ATG-H与TMZ联合应用显著增强了对TMZ耐药GBM细胞的杀伤效果，抑制了肿瘤生长，延长了小鼠生存期。分子水平上，ATG-H处理恢复了miR-92b-3p/-5p平衡，上调了HDAC9表达，下调了FOXP3和COL7A1表达。

研究结论与意义

本研究系统阐明了miR-92b链选择失衡在GBM TMZ耐药中的关键作用及其分子机制。TUT4介导的pre-miR-92b尿苷化修饰导致miR-92b-3p/-5p比率升高，通过靶向HDAC9和FOXP3增加H3K27ac水平，进而促进COL7A1转录和胶原沉积，最终诱导TMZ耐药。这一发现不仅揭示了TMZ耐药的新机制，还提出了通过调控miRNA链选择克服化疗耐药的新策略。

研究的创新性在于首次将miRNA链选择、表观遗传调控和ECM重塑联系起来，构建了从分子到微环境的完整调控网络。特别重要的是，研究发现临床已批准用于类风湿关节炎的金化合物ATG-H能够有效逆转TUT4介导的链选择失衡，恢复TMZ敏感性，这为GBM的临床治疗提供了潜在的联合治疗策略。

然而，研究也存在一定局限性，如miR-92b链选择在更大患者队列中的验证不足，以及ATG-H作为TMZ增敏剂的临床可行性仍需进一步验证。未来研究可进一步探索其他miRNA的链选择在肿瘤耐药中的作用，以及开发更特异的TUT4抑制剂用于临床治疗。

总体而言，该研究为理解GBM TMZ耐药提供了新视角，揭示了miRNA链选择作为表观遗传调控节点的功能，为开发新的治疗策略奠定了理论基础。针对miR-92b链选择的干预可能成为改善GBM化疗疗效的新途径，具有重要的临床转化潜力。