乳酸结合蛋白DNMT3A通过HIF-1α乳酸化上调VEGFA促进视网膜血管新生的机制研究

《Genome Biology》：Lactate-binding protein DNMT3A in HRMECs promotes angiogenesis by upregulating VEGFA through HIF-1α lactylation

本研究聚焦于眼部新生血管性疾病致盲的临床难题，围绕缺氧诱导的乳酸积累如何调控血管生成展开深入探索。研究人员通过蛋白质芯片筛选发现DNMT3A作为新型乳酸结合蛋白，证实其通过促进HIF-1α乳酸化上调VEGFA表达，进而驱动人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）的血管生成进程。该研究首次揭示乳酸-DNMT3A/HIF-1α乳酸化/VEGFA信号轴在病理性血管生成中的核心作用，为糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等血管性眼病提供了新的治疗靶点。

　　

当我们凝视世界时，视网膜上精密分布的血管网络正悄然维持着眼部的营养供给。然而在糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等疾病中，这种平衡会被病理性新生血管（Neovascularization, NV）打破，成为致盲的主要元凶。缺氧作为关键的始动因素，会促使细胞代谢转向糖酵解，导致乳酸大量积累。近年来研究发现，乳酸不仅是代谢产物，更可作为信号分子通过蛋白质乳酸化（lactylation）修饰参与基因表达调控。但乳酸如何精确调控眼部血管生成，其背后的分子机制仍是未解之谜。

为揭开这一谜题，重庆医科大学附属第一医院侯胜平教授团队在《Genome Biology》发表重要研究成果。研究团队通过构建氧诱导视网膜病变（Oxygen-Induced Retinopathy, OIR）小鼠模型，发现视网膜乳酸水平与病理性血管生成严重程度呈正相关。体外实验进一步证实，乳酸处理可显著增强人视网膜微血管内皮细胞（Human Retinal Microvascular Endothelial Cells, HRMECs）的成管、迁移和增殖能力，而单羧酸转运蛋白1（Monocarboxylate Transporter 1, MCT1）抑制剂AZD3965则能逆转这一效应。

为系统识别乳酸的作用靶点，研究人员创新性地采用包含2万种蛋白质的HuProt芯片进行筛选，发现DNA甲基转移酶3A（DNA Methyltransferase 3A, DNMT3A）与乳酸具有高亲和力结合（K_d=3.58±0.27μM）。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析显示，乳酸结合蛋白显著富集于细胞-基质粘附等通路。随后的机制解析表明，DNMT3A可作为乳酸转运载体促进其核内转移，进而诱导缺氧诱导因子1α（Hypoxia-Inducible Factor-1α, HIF-1α）发生乳酸化修饰。这种新型翻译后修饰（Post-Translational Modification, PTM）能增强HIF-1α与血管内皮生长因子A（Vascular Endothelial Growth Factor A, VEGFA）启动子的结合能力，最终上调VEGFA表达驱动血管生成。

关键技术方法

研究采用氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型模拟病理性血管生成过程；通过HuProt 20K蛋白质芯片筛选乳酸结合蛋白；利用微尺度热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）技术验证蛋白-小分子相互作用；运用慢病毒转染技术构建DNMT3A过表达/敲低HRMECs模型；采用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）等技术分析蛋白修饰与基因调控机制。

乳酸促进视网膜血管生成

通过检测OIR模型七个时间点（P4-P24）的视网膜乳酸水平，发现乳酸浓度与血管病变严重程度呈正相关。外源性L-乳酸注射显著加重了小鼠视网膜病理性血管生成，而MCT1抑制剂AZD3965处理则有效抑制了HRMECs的成管、迁移和增殖能力。这些结果从体内外层面共同证实了乳酸在血管生成中的关键作用。

乳酸结合蛋白的鉴定

采用生物素标记的乳酸进行蛋白质芯片筛选，从2万种蛋白中鉴定出222个候选乳酸结合蛋白。DNMT3A以最高IMean比值（3.56）引起关注，MST实验进一步证实其与乳酸的直接结合。缺氧和乳酸处理均能上调DNMT3A表达，且伴随HIF-1α乳酸化水平升高，提示DNMT3A可能参与乳酸介导的HIF-1α修饰调控。

DNMT3A通过HIF-1α乳酸化调控血管生成

在HRMECs中过表达DNMT3A可显著提升VEGFA表达和HIF-1α乳酸化水平，增强细胞血管生成能力；而敲低DNMT3A则产生相反效果。值得注意的是，AZD3965处理可消除DNMT3A过表达带来的促血管生成效应，表明DNMT3A的功能发挥依赖于乳酸摄取。ChIP实验证实乳酸能促进HIF-1α与VEGFA启动子结合，而甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR, MSP）排除了DNMT3A通过甲基化调控HIF-1α表达的可能性。

体内验证信号通路

OIR小鼠视网膜免疫荧光显示，P17时期（血管生成高峰）DNMT3A、VEGFA和HIF-1α乳酸化水平显著上调。活细胞成像实验动态捕捉到乳酸处理促进GFP-DNMT3A的核内转移过程，且DNMT3A敲低显著降低细胞内乳酸含量，从时空维度证实了DNMT3A的乳酸转运功能。

研究结论与意义

本研究首次描绘了"乳酸-DNMT3A/HIF-1α乳酸化/VEGFA"信号轴在视网膜血管生成中的完整调控机制。创新性地发现DNMT3A除甲基转移酶功能外，还具有乳酸核转运载体的新功能。HIF-1α乳酸化作为一种新型表观遗传调控方式，为理解缺氧应激反应提供了新视角。该研究不仅深化了对病理性血管生成分子机制的认识，更为糖尿病视网膜病变等血管性眼病提供了新的治疗靶点。针对这一通路的干预策略，有望突破现有抗VEGF治疗的局限性，为致盲性眼病防治开辟新的途径。