基于纤维化部分肝切除模型AFP+/DLK1+双阳性肝干细胞/祖细胞的分离鉴定及其再生机制研究

《Stem Cell Research & Therapy》：Isolation and characterisation of AFP+/DLK1+ double-positive hepatic stem/progenitor-like cells from fibrotic partial hepatectomy model

本研究针对肝纤维化背景下肝再生机制不清、肝干细胞/祖细胞（HSPCs）分离困难等难题，通过建立CCl4诱导的纤维化部分肝切除（PHx）模型，首次采用Percoll密度梯度离心法成功分离出AFP+/DLK1+双阳性HSPC样细胞。研究证实该细胞群具有干细胞特性，在肝再生高峰期（48小时）富集于50-70% Percoll层，为肝病细胞治疗提供了新型候选细胞源。

　　

在古希腊神话中，普罗米修斯被缚高加索山巅，每日遭恶鹰啄食肝脏，而他的肝脏总能奇迹般再生——这个古老传说恰恰印证了肝脏非凡的再生能力。现代医学研究表明，哺乳动物肝脏在遭受70%切除后，仍能在数周内恢复原有重量和功能。然而，当肝脏存在纤维化或肝硬化等基础病变时，再生过程就会变得复杂而低效，这成为临床肝切除手术面临的重要挑战。

目前，部分肝切除（PHx）仍是各种肝病治疗策略中最有效的方法，但大多数肝癌患者常伴有肝纤维化或肝硬化并发症。在纤维化肝脏中，肝小叶基本结构被破坏，再生肝细胞只能形成缺乏正常功能的假小叶，导致再生效果大打折扣。因此，阐明纤维化肝脏的再生机制，特别是肝干细胞/祖细胞（HSPCs）在其中的作用，具有重要临床意义。

HSPCs是一类具有干细胞特性的细胞，能够自我更新、增殖，并双向分化为肝细胞和胆管上皮细胞，在肝脏修复和再生中具有广阔应用前景。然而，HSPCs的分离、鉴定和体外培养仍面临挑战。传统流式细胞分选技术虽能分离HSPCs，但荧光染料的使用可能限制其临床应用。

为解决这一难题，Sun等研究人员在《Stem Cell Research & Therapy》上发表的最新研究中，创新性地从纤维化PHx模型中分离鉴定出AFP⁺/DLK1⁺双阳性HSPC样细胞。甲胎蛋白（AFP）是一种糖蛋白，在胚胎发育过程中由胎儿肝细胞和卵黄囊细胞产生，成年后表达水平极低，但在肝损伤时特异性激活。Delta样非经典Notch配体1（DLK1）属于NOTCH非经典配体家族，在胎儿和成人阶段参与调节干细胞池的维持，是肝母细胞的标志物。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过CCl₄皮下注射建立小鼠肝纤维化模型并实施2/3 PHx手术；使用密度梯度差速离心法分离肝非实质细胞；通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光和流式细胞术分析细胞标志物表达；采用组织学染色（HE、天狼星红、Masson三色）评估肝纤维化程度。实验样本来自ICR小鼠，在PHx后12小时、24小时、48小时、4天和7天时间点采集。

肝纤维化模型成功建立

研究团队通过皮下注射20% CCl₄（0.02 mL/g）到小鼠背部，每周两次，持续8周，成功建立了肝纤维化模型。与对照组相比，模型组小鼠体重增长缓慢，肝脏外观暗黄、质地坚硬呈颗粒状。血清ALT和AST水平显著升高，组织学检查显示明显的肝细胞变性、脂肪空泡积累、炎性细胞浸润和胶原沉积。Western blot分析证实胶原III、胶原I和α-SMA蛋白表达水平显著增加，病理学家根据Scheuer评分系统确认纤维化达到S2期。

CCl₄预注射促进2/3 PHx后肝再生

在建立肝纤维化模型一周后，研究人员对纤维化模型小鼠进行2/3 PHx，并在术后不同时间点采集样本。肝/体重比显示，纤维化PHx小鼠在术后48小时比值较高。血清ALT和AST水平在两组中呈现相似变化模式：术后初期肝损伤严重，48小时逐渐恢复正常。有趣的是，纤维化小鼠的ALT、AST水平在术后12-48小时低于对照小鼠，而在4天时呈现相反趋势。

基因表达分析显示，干细胞性和增殖相关基因（Afp、Dlk1、Lgr5、Ki67、HNF4α）在48小时显著上调，且纤维化PHx组的表达水平高于正常PHx组。肝功能相关基因Alb在正常组48小时显著增加，而纤维化PHx组的Alb表达显著低于正常PHx组。免疫荧光分析进一步证实，AFP和DLK1表达在术后12小时开始检测到，48小时达到峰值，4天后下降。

密度梯度差速离心法成功分离AFP⁺/DLK1⁺双阳性细胞

为最大限度减少分离过程中的细胞损伤，研究人员制备了三种Percoll密度梯度溶液（30%、50%和70%）进行细胞分离提取。通过基于肝细胞不同漂浮密度的多步离心纯化，最终从纤维化PHx模型再生肝中分离出AFP⁺/DLK1⁺双阳性细胞。

流式细胞术分析显示，30%层主要包含细胞碎片，而50-70% Percoll层在48小时含有最高比例的AFP⁺/DLK1⁺双阳性细胞。qRT-PCR分析证实，50-70% Percoll层细胞中Afp、Dlk1、Lgr5和Ki67的表达显著高于其他层。值得注意的是，Afp在24小时保持高表达，而Dlk1在48小时呈现高表达水平。细胞免疫荧光分析进一步验证了AFP⁺/DLK1⁺双阳性表达，48小时组的双阳性细胞比例显著高于24小时组。

本研究首次证实了AFP和DLK1可作为从纤维化PHx模型中选择HSPC样细胞群的潜在标志物。研究发现纤维化肝脏在PHx后48小时呈现最旺盛的再生活性，是分离提取HSPC样细胞的最佳时期。通过密度梯度差速离心法成功分离的AFP⁺/DLK1⁺双阳性细胞具有干细胞样特性，并参与肝再生过程。

值得注意的是，与胚胎HSPCs不同，来自纤维化病变个体的HSPC样细胞群表现出固有的脆弱性，在体外培养中面临挑战。研究人员指出，下一步将致力于克服纤维化PHx模型分离的HSPC样细胞长期培养的局限性，如优化缺氧培养基、与基质细胞共培养等。

该研究为肝病细胞治疗提供了新的候选细胞源，特别是针对伴有基础肝病的患者群体。通过无毒性Percoll密度梯度离心法替代传统流式细胞分选技术，为HSPCs的临床应用扫除了技术障碍。未来研究将聚焦于体外扩增策略优化以及细胞移植功能验证，进一步推动肝再生医学的发展。