核壳结构多功能微针贴片通过协同抗菌-抗炎-干细胞招募策略加速感染性糖尿病伤口愈合

《Stem Cell Research & Therapy》：A core-shell multifunctional microneedle patch accelerates infected diabetic wound healing

本研究针对糖尿病伤口存在的血管生成受损、细菌感染耐药和微环境氧化损伤等临床难题，开发了一种核壳结构多功能微针贴片（CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL）。该贴片外壳由壳聚糖（CS）包裹SDFP多肽，内核为透明质酸（HA）负载银金属有机框架-巴马汀复合物（Ag@MOF-PAL）。实验证明该贴片可有效清除金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌等常见致病菌，通过抑制NF-κB和MAPK信号通路缓解慢性炎症，并在微环境改善后释放SDFP招募脂肪源性干细胞（ADSCs）促进血管生成。在糖尿病大鼠感染伤口模型中，该贴片显著加速伤口愈合，为糖尿病伤口治疗提供了新策略。

　　

糖尿病并发症严重威胁患者健康，其中糖尿病足溃疡（DFU）是最常见的并发症之一，影响着15-25%的糖尿病患者。令人担忧的是，约60%的截肢病例与DFU相关。当前标准治疗方法包括清创、抗感染治疗和伤口敷料更换，但效果往往不理想。抗生素的过度使用导致细菌耐药性不断增强，而频繁更换敷料不仅给患者带来疼痛，还会造成二次创伤，显著降低患者依从性。因此，开发创新且高效的方法来加速伤口愈合变得日益迫切。

在这一背景下，微针（MN）技术作为一种有前景的解决方案脱颖而出。这种由阵列针尖和基底组成的微针可以穿透物理屏障，直接将治疗药物递送到深层组织，从而提高药物稳定性和递送效率。特别是对于糖尿病伤口，微针尖端能够穿透生物膜，帮助抗菌剂分散到感染组织中，增强其抗菌活性。然而，细菌和坏死细胞降解会释放病原性核酸片段，引发炎症反应，导致过度细胞因子分泌和持续免疫激活，这仍然是需要解决的关键问题。

发表在《Stem Cell Research & Therapy》的这项研究中，魏康等人设计了一种核壳结构多功能微针贴片（CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL），旨在同时解决糖尿病伤口的细菌感染、慢性炎症和组织再生难题。该贴片采用巧妙的核壳设计：外壳由壳聚糖（CS）包裹SDFP多肽（CS-SDFP），内核则由10,000 MV透明质酸（HA）、蔗糖和负载巴马汀（PAL）的银金属有机框架（Ag@MOF-PAL）组成。

研究团队通过水热法合成银金属有机框架（Ag@MOF），并利用真空辅助微模塑技术制备具有核壳结构的微针贴片。该贴片包含10×10阵列的锥形微针，每根微针基底半径为200μm，高度为850μm，尖端半径约10μm，分布面积7mm×7mm。体外实验表明，该微针贴片具有良好的生物相容性，不会引起溶血现象，对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）无毒性作用。

主要技术方法

研究采用水热法合成银金属有机框架（Ag@MOF），通过真空辅助微模塑技术构建核壳结构微针贴片。利用场发射扫描电镜（FESEM）和元素映射分析表征材料形貌，通过细菌活力染色和晶体紫染色评估抗菌效果和生物膜清除能力。建立糖尿病Sprague Dawley大鼠铜绿假单胞菌感染伤口模型，通过组织染色、免疫荧光和Western blot等技术分析伤口愈合情况、炎症反应和相关信号通路。细胞实验采用CCK-8法检测细胞活力，Transwell和小室迁移实验评估细胞迁移能力。

表征和细胞毒性

图2展示了Ag@MOF-PAL的合成过程及表征结果。扫描电镜图像显示合成的Ag@MOF具有独特的结构，元素映射分析证实其富含银含量。将Ag@MOF与PAL结合形成Ag@MOF-PAL后，与16% HA和16%蔗糖混合制备HA-Ag@MOF-PAL。紫外-可见光谱显示不同合成样品的特征吸收峰。

微针贴片的制备过程如图3a所示。场发射扫描电镜显示CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针呈现锥形形态（图3b）。通过罗丹明B标记CS-SDFP，FITC标记HA-Ag@MOF-PAL，荧光成像证实了微针的核壳结构（图3c-d）。力学测试显示微针贴片具有合适的机械性能，溶血实验表明其具有良好的血液相容性（图3e）。CCK8细胞活力实验证明微针提取物对HUVECs活性无影响（图3f），证实了该微针贴片的生物安全性。

体外抗菌效果

研究人员评估了微针贴片对常见伤口感染细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌）的抗菌性能。SYTO-9/PI细菌活力染色显示，经微针贴片处理24小时后，三种细菌的存活率均显著降低（图4a-b）。场发射扫描电镜观察发现，阴性对照组和CS-SDFP/HA微针贴片组中的细菌细胞膜相对光滑、形态完整，而含有Ag@MOF的微针贴片处理组则出现细胞膜完整性受损（图4c）。抑菌圈实验显示，CS-SDFP/HA-Ag@MOF和CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片对三种细菌均产生明显的抑菌圈（图4d-e）。此外，含Ag@MOF的微针贴片能有效清除三种细菌的体外生物膜（图4f-g），表明微针贴片的抗菌活性主要归因于Ag@MOF成分。

加速感染性糖尿病伤口愈合

通过在糖尿病SD大鼠背部创建铜绿假单胞菌感染的全层皮肤缺损模型，研究人员评估了微针贴片的体内治疗效果。如图5a所示实验时间安排，在铜绿假单胞菌感染2天后，伤口接受不同微针贴片处理。图5b展示了不同时间点各组伤口的代表性图片，伤口大小变化通过模拟方法进行评估（图5c）。伤口愈合率分析表明，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片治疗显著加速了糖尿病大鼠感染伤口的愈合（图5d）。主要器官组织学分析未观察到明显毒性（图S1c）。为评估微针贴片的抗菌效果，研究人员在不同时间点从伤口分离铜绿假单胞菌并在LB琼脂平板上培养（图5e）。OD600 nm测量显示，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL处理组伤口中几乎检测不到存活的铜绿假单胞菌（图5f），表明该微针贴片在体内具有优异的抗菌效果。

促进皮肤修复

通过组织学分析进一步验证微针贴片促进伤口愈合的潜力。苏木精-伊红（H&E）染色显示，第18天时，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片处理组大鼠伤口几乎完全闭合（图6a）。与其他组相比，该处理组肉芽组织长度显著缩短（图6b）。Masson染色评估胶原沉积情况，第18天时，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL处理组伤口胶原沉积增强（图6c），胶原体积分数（CVF）达到70.18%±6.264%，显著高于其他组（图6d）。免疫荧光图像显示，经CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片处理后，COL1a蛋白表达增加（图6e-f），表明该微针贴片能有效促进伤口部位血管生成，加速糖尿病SD大鼠感染伤口愈合。

抗炎作用

CCK8实验表明PAL对HUVECs无毒性（图S2a）。LPS（100 ng/ml）刺激后，Il1b、Il6、Tnfa和Inos表达显著上调，但PAL给药后这些变化明显逆转（图S2b）。为进一步评估微针贴片的抗炎效果，用CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片提取物处理RAW 264.7细胞（图7a）。结果显示，微针贴片提取物能显著抑制LPS诱导的炎症标志物（Il1b、Il6、Tnfa和Nos2）高表达（图7b）。Western blot分析表明，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片能显著降低NF-κB（IKKα/β、P65和IKBα）和MAPK（JNK、ERK和P38）通路的磷酸化水平（图7c-f）。IL-6免疫组化染色显示，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL处理能显著减少伤口部位炎症，IL-6分泌明显低于其他组（图7g-h），证实了其强大的抗炎作用。

招募干细胞和促进血管生成

脂肪源性干细胞（ADSCs）广泛存在于脂肪组织中，通过旁分泌机制发挥多种治疗作用，包括促进血管生成、抑制凋亡和调节免疫反应。CCK8实验表明SDFP对HUVECs（图S3a）和ADSCs（图S3b）均无毒性。Transwell实验（图S3c-d）证实SDFP能加速ADSCs体外迁移。将ADSCs与来自不同刺激条件的RAW 264.7细胞条件培养基共培养（图8a），发现在炎症环境中ADSCs迁移受到抑制，但CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL处理能显著促进ADSCs体外迁移（图8b-e）。C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）作为SDF-1α的受体，在ADSCs中高表达。免疫荧光染色显示，在所有实验组中，G4组ADSCs比例最高（8.35%±0.636%）（图8f-g）。划痕实验证明在炎症环境中HUVECs迁移受损，但CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL治疗能加速HUVECs体外迁移（图8h-i）。CD31免疫荧光染色表明，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL组伤口部位微血管密度显著更高（6.89%±0.6%）（图8j-k），证明该微针贴片能有效招募干细胞并促进血管生成。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种多功能核壳结构微针贴片，集抗菌、抗炎和促进干细胞迁移功能于一体，显著改善了感染性伤口的愈合过程。该贴片的巧妙设计使其能够按需释放不同活性成分：首先由Ag@MOF清除常见伤口感染细菌，随后PAL通过抑制NF-κB和MAPK信号通路缓解慢性炎症，最后在微环境改善后，SDFP招募周围ADSCs促进血管生成和组织修复。

在糖尿病大鼠铜绿假单胞菌感染伤口模型中，CS-SDFP/HA-Ag@MOF-PAL微针贴片展现出卓越的治疗效果，包括快速消除细菌、加速伤口闭合、减轻炎症反应以及促进组织再生和血管生成。重要的是，该微针贴片在大鼠主要器官中未表现出毒性，具有良好的生物安全性。

该研究的意义在于提出了一种综合解决糖尿病伤口多重病理因素的创新策略。与传统单一作用机制的治疗方法相比，这种时序控制释放系统能够更好地模拟伤口愈合的自然过程，针对不同愈合阶段的关键问题提供针对性解决方案。特别是利用SDFP多肽替代全长SDF-1α蛋白，不仅降低了治疗成本，还提高了稳定性，有利于临床转化应用。

未来研究可进一步探索该微针贴片的长期生物相容性，并评估其在其他类型慢性伤口中的应用潜力。这种多功能微针贴片为代表的新型治疗策略开辟了新的方向，有望为临床糖尿病伤口管理提供更有效的解决方案。