综述：功能化间充质干细胞增强骨再生：进展与挑战

《Stem Cell Research & Therapy》：Functionalized mesenchymal stem cells for enhanced bone regeneration: advances and challenges

本综述系统阐述了功能化间充质干细胞（MSCs）在骨再生领域的最新进展与挑战。文章深入探讨了通过基因修饰、预处理、纳米颗粒整合及支架递送等策略增强MSCs成骨潜能的方法，并分析了其在激活骨形态发生蛋白（BMP）和Wnt等关键信号通路中的作用。尽管临床前成果显著，但规模化生产、免疫兼容性及监管路径等挑战仍需解决，文中还展望了精准工程植入物和人工智能驱动设计等未来方向，为骨再生治疗提供了重要参考。

　　

引言

骨骨折是临床实践中最常见的损伤之一，但在涉及临界尺寸缺损、延迟愈合、骨不连或患有骨质疏松症、糖尿病或癌症等全身性疾病的患者中，其治疗变得尤为困难。传统的治疗策略包括自体骨和同种异体骨移植，存在供区并发症、移植物可用性有限、免疫排斥和移植物整合率可变等显著局限性。此外，合成生物材料虽然可作为临时支架，但往往缺乏骨诱导潜力，无法完全重现强健骨再生所需的复杂细胞信号传导。近年来，再生医学已将焦点转向支持并刺激机体内在愈合机制的生物活性方法。其中，基于干细胞的疗法已成为促进骨修复的一种变革性策略。间充质干细胞（MSCs）因其多能性、易于从多种组织（骨髓、脂肪组织、脐带）中分离以及能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力而受到广泛关注。更重要的是，MSCs通过分泌细胞因子、生长因子和外泌体发挥强大的旁分泌作用，促进血管生成、免疫调节和细胞外基质重塑——这是骨再生级联反应中的关键组成部分。

间充质干细胞的生物学和治疗特性

MSCs是从各种成体和围产期组织（包括骨髓、脂肪组织和脐带）中提取的多能基质细胞。虽然骨髓来源的MSCs（BM-MSCs）因其高成骨潜力仍然是研究最多的，但脂肪来源的MSCs（AD-MSCs）和脐带来源的MSCs（UC-MSCs）具有显著的临床优势。AD-MSCs可通过微创程序（如吸脂术）更容易地获取，细胞产量显著更高（每克脂肪组织超过5000个细胞，而每毫升骨髓仅含100-1000个MSCs），并且在体外表现出更强的增殖能力。UC-MSCs可以从废弃的脐带中无痛收集，不受伦理限制，并且在MSC来源中表现出最高的增殖率和克隆形成潜力，同时衰老标志物（p53、p21、p16）的表达减少。这些独特的属性使得AD-MSCs和UC-MSCs对于可扩展的再生疗法极具吸引力，特别是在需要大剂量细胞时。最近的研究认为牙髓干细胞（DPSCs）是骨再生的一种有前景的MSC来源，因其多能性、丰富的可用性和微创获取性。DPSCs在体外表现出强大的成骨分化能力，表达ALP、I型胶原、BMP-2/4、骨粘连蛋白、骨桥蛋白和骨钙素等标志物，并能在成骨诱导培养条件下形成矿化结节。体内Meta分析表明，基于DPSC的干预措施相较于对照组显著增加了新骨面积和体积。2024年的一篇综述进一步强调了DPSCs的临床吸引力， citing their easy accessibility, low immunogenicity, and potential for both cell-based and cell-free bone regenerative strategies。此外，基于支架的体内研究显示，将DPSCs与生物材料结合可以几乎完全恢复临界骨缺损的结构，形成血管化良好的板层骨，增加TGF-β1水平，并营造有利的骨微环境。MSCs通常通过表面标志物CD73、CD90和CD105的表达，以及造血标志物CD34、CD45和HLA-DR的缺失来鉴定。然而，这些标志物的表达会因组织来源和培养条件的不同而有所差异，表明表型异质性可能影响治疗性能。MSCs具有强大的分化能力，尤其是在成骨诱导条件下向成骨细胞谱系分化，这使其在骨组织工程中极具吸引力。这种成骨分化受到RUNX2等转录因子以及Wnt/β-catenin和BMP等信号通路的严格调控。除了再生能力，MSCs在免疫调节中也起着关键作用，通过抑制T细胞增殖、诱导调节性T细胞以及分泌前列腺素E2、TGF-β和白介素-10等免疫抑制分子发挥抗炎作用。这些特性增强了它们在骨愈合治疗中的实用性，特别是在炎症或免疫受损的情况下。

MSCs的增殖潜力因其组织来源而异，这显著影响其临床规模应用的适用性。例如，脐带来源的MSCs（UC-MSCs）与BM-MSCs和AD-MSCs相比，显示出明显更高的群体倍增极限和更快的扩增速率。相反，在一项犬MSCs的比较研究中，脂肪来源的MSCs（AD-MSCs）表现出最短的群体倍增时间，表明其具有优越的体外生长速率。供体特征（如年龄）深刻影响MSCs的增殖。来自22-35岁供体的胎盘来源MSCs相较于年轻或年长供体的细胞，显示出增强的生长速率和集落形成效率。此外，衰老会降低各组织来源MSCs的增殖潜力；年轻供体保留着更优的自我更新能力。培养条件和来源依赖性异质性也调节增殖行为。培养密度、氧张力和细胞分离方法等因素显著影响复制潜力和衰老起始。

在临床上，MSCs已被研究用于各种骨科应用，包括骨不连骨折、临界尺寸骨缺损、股骨头坏死、脊柱融合和骨囊肿。

早期临床试验报道了令人鼓舞的结果，基于MSCs的疗法能促进骨再生、减轻疼痛并减少对自体移植物的需求。然而，尽管有这些前景，MSCs疗法的临床转化仍面临显著挑战，特别是在供体间变异性、大规模生产、免疫兼容性和监管批准方面。此外，MSCs疗法从实验室到临床的转化受到缺乏标准化方案和递送方法可变性的限制。尽管如此，生物材料工程、支架设计和细胞功能化方面的持续发展正在不断提高MSCs在骨组织修复中的成骨性能和临床适用性。

成骨作用与骨愈合级联反应

骨折后，修复级联反应始于炎症阶段，其特征是血肿形成和免疫细胞浸润，这些细胞释放细胞因子和趋化因子，将MSCs募集至损伤部位。免疫细胞释放一系列细胞因子和趋化因子，包括白介素（IL-1、IL-6、IL-11、IL-18）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和血小板衍生生长因子（PDGF）等，以启动骨折愈合的炎症阶段。随后的修复阶段涉及MSCs的增殖和成骨分化，以及血管生成和细胞外基质沉积。MSCs通过分化为负责新骨形成的成骨细胞而发挥核心作用。这种分化受复杂的信号网络调控，包括激活成骨谱系定向所需的主转录因子RUNX2。其他关键通路包括促进成骨细胞成熟和矿化的Wnt/β-catenin通路、增强早期成骨诱导的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）通路，以及通过与骨微环境相互作用参与成骨调控的Notch信号通路。除了成骨作用，MSCs还通过分泌VEGF等促血管生成因子支持新生血管形成，从而确保骨组织再生所需的充足营养和氧气供应。它们还通过产生MMP-2和MMP-9等酶参与基质重塑，促进从软痂到矿化骨结构的过渡。通过对骨形成、血管生成和重塑的综合作用，MSCs作为骨愈合级联反应的协调者，使其成为增强骨折修复和解决骨不连缺损的关键靶点。

在炎症和成骨早期阶段之后，巩固阶段（第21-42天）将软痂转变为机械稳定的矿化硬痂，由强大的血管生成信号（特别是VEGF-A和血管生成素-2）驱动，促进血管侵入和基质矿化。此后，在重塑阶段（从约第42天开始并持续至第64天之后），编织骨通过RANKL-OPG轴介导的严格调控的吸收和形成动力学，逐渐被有序的板层骨所取代；具体而言，VEGF增强成骨细胞增殖并上调RANKL同时下调OPG，从而间接促进破骨细胞生成和协调的骨转换。同时，通过VEGFR1/VEGFR2的旁分泌/自分泌VEGF信号影响成骨细胞和内皮细胞的交叉对话，进一步支持骨痂的重塑和血管生成。

增强MSCs成骨的功能化策略

为了增强MSCs在骨再生中的治疗效率，已经设计了一系列功能化策略，通过遗传、表观遗传、生物物理和纳米工程方法来调节其成骨潜力。

基因工程已成为基石策略，其中MSCs通过病毒或非病毒载体转染成骨诱导基因，如BMP-2、RUNX2和VEGF。这些遗传干预不仅放大了细胞固有的分化能力，还增强了局部血管生成，这对矿化组织形成至关重要。病毒递送方法，如慢病毒和腺病毒载体，已显示出高转染效率；然而，它们也引起了关于插入突变和长期安全性的担忧，这仍然是临床转化中的一个关键监管挑战。

表观遗传调控提供了一种非整合性策略来改变MSCs的行为。MicroRNAs如miR-26a、miR-29b和miR-21已被鉴定为成骨作用的有效调节因子，因其能够抑制抑制性信号通路（如GSK-3β、Smad7），从而促进成骨基因的表达。通过脂质纳米颗粒或外泌体递送的合成miRNA模拟物或抑制剂，在临床前骨折模型中已显示功效，能增强基质矿化和成骨细胞标志物表达。最近的研究强调了间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSCs-sEVs）作为microRNAs（miRNAs）递送载体在骨再生中的治疗潜力。通过调节基因表达，这些miRNAs影响关键细胞过程，如成骨细胞增殖、迁移和分化。例如，富含miR-21-5p、miR-126-5p、miR-29a和miR-27a-5p的sEVs已证明通过调控KLF3、VASH1、Atg4B和IGFBP3等靶点，在增强成骨作用、血管生成和基质矿化方面具有功效。MSCs-sEVs中的几种miRNAs已被证明可激活成骨信号通路，包括Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、NF-κB和RhoA/ROCK，而其他一些则通过如SMAD2/ERK和BMPR2/Smad1/5/9等通路下调成骨标志物（RUNX2、ALP、OCN）来抑制成骨作用。值得注意的是，sEVs内的长链非编码RNAs（lncRNAs）通过作为竞争性内源性RNA，隔离miRNAs，从而促进成骨诱导基因的表达，进一步优化成骨反应。

除了成骨作用，MSCs-sEVs在抑制破骨细胞分化和促进血管生成（对骨重塑至关重要）方面发挥关键作用。miRNAs如miR-21、miR-27a和miR-6924-5p抑制骨吸收，而其他（如miR-21/NOTCH1/DLL4轴和miR-126/PI3K/AKT通路）则促进血管发育。此外，sEVs通过诱导M2巨噬细胞极化和减轻炎症来促进免疫调节，从而为骨再生创造有利的微环境。MSCs-sEVs通过靶向递送miRNAs和lncRNAs在协调骨再生中的多方面作用——强调了它们在再生医学和骨组织工程中的前景。

生物物理和生化预适应策略通过将MSCs暴露于定制的微环境中进一步增强了其成骨准备状态。通过循环应变或流体剪切应力进行的机械刺激已被证明能上调机械敏感通路，如YAP/TAZ和整合素-FAK信号，从而加强成骨谱系定向。低氧预适应（1-5% O₂）模拟体内生态位条件，并与增强的血管生成因子分泌及改善的细胞存活率相关。生化线索，如地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸，仍然是指导成骨预适应的标准体外添加剂。

纳米颗粒介导的功能化引入了用于MSC工程的多功能工具包，实现了靶向递送和实时成像。用成骨诱导分子（BMP-2、RGD肽）修饰的金和二氧化硅纳米颗粒允许在缺损部位控制释放和局部活性。磁性纳米颗粒，特别是那些涂覆有聚-L-赖氨酸或明胶的，提供了磁引导递送，改善了保留率和空间控制。

最近的研究还表明，此类纳米颗粒可通过磁机械刺激激活机械转导通路，进一步增强成骨作用。然而，这些纳米材料的长期安全性需要更彻底的讨论。金纳米颗粒尽管具有成骨诱导潜力，但表现出剂量依赖性细胞毒性，在高浓度下可诱导活性氧生成和膜损伤。二氧化硅纳米颗粒与骨细胞的相互作用高度依赖于尺寸、表面化学和蛋白质冠的形成，这可能不可预测地改变细胞反应和毒性特征。此外，虽然如SPIONs的磁性纳米颗粒能够增强细胞归巢、追踪和机械转导，但对聚集、潜在的铁介导的氧化应激、免疫激活以及在深部组织中有限的体内定位的担忧仍然存在。因此，在预测临床可行性之前，必须通过剂量反应研究、生物降解评估和临床前试验严格评估这些长期生物相容性和安全性问题。

除了纳米材料，钙基生物分子如氯化钙（CaCl₂）和氨基钙（AC）因其骨传导特性而在骨再生中受到关注。氨基钙在去卵巢大鼠中显示出显著的骨保存效果，增强骨体积和小梁连接性，同时上调MC3T3-E1细胞中的成骨标志物如IBSP和BGLAP。类似地，CaCl₂当整合到生物陶瓷或聚合物支架中时，能改善压缩强度、矿化和细胞粘附。AC和CaCl₂的长期生物降解性、免疫原性和系统性效应仍然特征不足。因此，严格的体内研究对于验证其生物相容性和临床安全性至关重要。

细胞表面修饰技术已被开发用于增强归巢效率以及与骨组织的相互作用。配体-受体策略，如将MSC表面与RGD基序、CXCR4或整合素靶向肽结合，改善了与发炎或受损内皮的粘附，并促进了位点特异性聚集。使用细胞外基质蛋白（如纤连蛋白或骨桥蛋白）的仿生涂层已被证明能增加整合素介导的粘附和下游成骨信号传导。这些多方面的策略强调了向精准MSC疗法的进展。通过整合遗传、生化、物理和表面工程工具，研究人员现在能够微调MSCs的治疗特性，以满足骨愈合的复杂需求，特别是在具有挑战性的临床情景中，如临界尺寸缺损或骨质疏松性骨折。

MSCs递送平台与生物工程整合

鉴于骨再生中干细胞疗法的疗效，已开发出先进的递送平台和生物工程策略以优化其效果。3D生物打印支架可精确控制结构特征，增强细胞附着、增殖和分化。这些支架常与成骨诱导因子结合以进一步支持骨形成。基于水凝胶的可注射载体提供了灵活性并实现了微创递送，在促进生物活性分子持续释放的同时为细胞提供保护。基于微载体的系统有助于培养期间的细胞扩增并促进有效移植，改善细胞存活。生物功能化植入物表面引导细胞迁移和分化，促进组织整合和骨整合。此外，外泌体负载细胞正在成为一种新方法，利用外泌体中的生物活性分子增强组织再生并改善治疗结果。

递送平台

主要特征

优势

挑战

参考文献

3D生物打印支架

可定制的3D打印支架，用于精确骨缺损修复。

高精度，支持细胞生长、成骨。

高成本，技术复杂。

[106]

水凝胶和可注射载体

水凝胶用作MSC递送的可注射载体。

易于注射，适应各种缺损形状，生物相容性好。

机械强度有限，突释。

[107]

基于微载体的MSC扩增

用于MSC培养扩增的可生物降解微载体。

高效的细胞扩增，可扩展用于临床应用。

长期稳定性有限，操作挑战。

[108]

生物功能化植入物表面

用生物活性分子功能化的植入物以增强MSC粘附。

增强细胞附着和分化，改善整合。

体内维持生物活性困难。

[109]

外泌体负载的功能化MSCs

负载外泌体的MSCs以增强治疗效果。

增强再生潜力，靶向治疗。

外泌体分离困难，可扩展性问题。

[110]

电纺纳米纤维支架

模拟细胞外基质的纳米纤维用于MSC培养。

高比表面积，可定制的纤维排列，促进成骨。

可扩展性低，纤维取向问题。

[111]

基于微球的药物递送

用于控制释放MSCs或生长因子的可生物降解微球。

持续释放，增强细胞存活，靶向递送。

突释，释放控制有限。

[112]

纳米结构生物材料涂层

用纳米材料涂层植入物以增强MSC相互作用。

改善MSC粘附和成骨分化。

涂层一致性，免疫反应。

[113]

光聚合水凝胶

在紫外光下固化的水凝胶，封装MSCs。

精确控制支架形成，生物相容性好。

紫外敏感性，限于特定应用。

[114]

纳米纤维封装细胞疗法

MSCs封装在纳米纤维垫中，增强与基质相互作用。

促进分化和细胞迁移。

生产困难，细胞存活担忧。

[115]

自组装肽水凝胶

由肽自组装的水凝胶，支持MSC封装。

生物相容性好，促进成骨，易于功能化。

机械强度有限，稳定性问题。

[116]

ECM模拟支架

设计模拟天然骨细胞外基质的支架。

更好的MSC分化和与宿主组织整合。

模拟天然ECM特性困难。

[117]

用于MSC培养的微流控平台

为MSCs提供受控培养环境的微流控设备。

精确的营养和废物控制，支持MSC分化。

设计复杂，可扩展性问题。

[118]

优化MSCs骨再生疗法的药代动力学和药效学视角

理解功能化MSCs疗法的药代动力学（PK）和药效学（PD）对于优化其在骨再生中的临床转化至关重要。在全身或局部给药后，MSCs的生物分布受多种因素影响，包括细胞表面修饰、递送途径以及是否存在炎症或缺氧微环境。一个主要的药代动力学限制涉及首过肺滞留，其中超过80%的输注细胞被滞留在肺部，限制了在骨缺损部位的生物利用度。功能化策略如SDF-1/CXCR4轴调节、整合素配体掺入和生物材料辅助细胞递送已显示出增强归巢效率和组织特异性保留的前景。MSCs主要通过旁分泌机制发挥其治疗作用，分泌一系列细胞因子、生长因子和细胞外囊泡，调节成骨、血管生成和免疫反应。增强策略如基因编辑（BMP-2过表达）、miRNA调节和纳米颗粒结合已被用于在体内延长和增强这些效应。然而，移植MSCs的短暂存活期及其分泌组的时效性有限，需要与持续释放递送系统整合以维持治疗效力。递送途径严重影响药代动力学和再生疗效。局部递送通过骨内注射、水凝胶支架或复合载体，通过实现细胞在缺损部位的直接沉积、增强细胞保留和促进骨微环境内持续的旁分泌信号，在骨愈合情境中提供了优越的结果。考虑到骨相对于神经或脊髓组织的血管相对较少，这限制了系统性MSCs迁移和在骨科适应症中的植入，这一点尤为重要。全身性递送虽然是非侵入性的，适用于弥漫性骨骼疾病，但常导致脱靶细胞积累（尤其是在肺和肝），并且需要策略来增强向骨组织的归巢能力。此外，全身性途径在灌注不良的骨病变中可能表现出不可预测的药效学，强调了位点特异性递送平台的重要性。

细胞基产品的PK/PD分析标准化仍然是当前转化管道中的一个关键空白。定量成像、生物分布测定和系统药理学模型正在被开发，以更好地预测细胞命运、最佳剂量和治疗窗口。随着监管机构对先进治疗医药产品（ATMPs）制定更严格的指南，将稳健的PK/PD框架纳入对于确保骨修复修饰MSCs疗法的安全性、有效性和批次间一致性至关重要。

临床前和临床证据

临床前研究在评估MSCs骨再生疗法的有效性和安全性方面起着关键作用。动物模型常被用于评估MSCs移植在骨骨折、临界尺寸缺损和骨质疏松性骨愈合中的效果。在骨折和缺损模型中，MSCs已被证明能增强骨痂形成、桥接临界尺寸间隙、加速矿化并通过骨密度（BMD）、组织学、微计算机断层扫描（μCT）和力学测试评估改善生物力学强度。值得注意的是，一项临床前骨再生中系统性MSCs给药的系统Meta分析显示，骨矿物质密度（SMD 3.02）、骨体积/组织体积（SMD 2.10）和新骨面积（SMD 7.03）显著增加。此外，在鼠类骨折模型中，全身和局部MSCs递送均增强了愈合，尽管全身性递送在弥漫性骨骼损伤中更可行。

在骨质疏松模型中，MSCs已显示出恢复骨量和微结构的潜力。在OVX诱导的骨质疏松动物中移植BM-MSCs导致骨密度、小梁厚度和成骨标志物（ALP、骨钙素）表达显著改善，同时TNF-α减少和小梁微结构增强。然而，未修饰同种异体MSCs的全身给药未能阻止骨质疏松大鼠的骨丢失，并且在某些情况下，重复注射加速了骨丢失，强调了需要靶向归巢增强策略，如整合素修饰或支架基递送。此外，骨质疏松个体中MSCs的再生能力似乎得以保留：来自骨质疏松患者的MSCs在骨折模型中表现出相当或更优的巩固效果，特别是在全身性递送后，与来自骨关节炎供体的MSCs相比。这些发现强调了需要明确的策略——局部递送可能更适用于孤立的骨缺损，而骨质疏松相关应用可能受益于工程化MSCs归巢机制以增强系统性靶向效力。

挑战与局限性

尽管具有再生潜力，MSCs骨修复的临床转化仍受若干关键限制的制约。首要问题之一是体内存活和植入差，大多数移植细胞由于骨损伤部位的恶劣微环境而无法持续存在或整合。免疫原性，特别是在同种异体应用中，存在宿主排斥的风险，而遗传或表观遗传修饰则引发了对肿瘤发生性的担忧。MSCs表面修饰方案在各实验室间差异很大，导致治疗结果不一致。从制造角度来看，大规模扩增、维持表型稳定性以及满足良好生产规范（GMP）要求的挑战进一步使临床转化复杂化。监管不确定性，加上关于细胞来源和操作的伦理担忧，继续阻碍标准化批准路径。此外，血管化不足、支架整合的复杂性以及缺乏长期安全性数据限制了更广泛的应用。总的来说，这些障碍强调了对符合监管和临床框架的稳健、可重复