综述：脂肪组织来源的小细胞外囊泡/外泌体在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病相关并发症发生或改善中的分子机制

《European Journal of Medical Research》：Molecular mechanisms linking adipose tissue-derived small extracellular vesicles/exosomes to the development or amelioration of obesity, insulin resistance, and diabetes-related complications

本综述系统阐述了脂肪组织来源的小细胞外囊泡（sEVs）/外泌体在肥胖相关代谢紊乱中的双重角色：既可通过携带特定微小RNA（miRNA）（如miR-222、miR-27a）和脂质（如神经酰胺）传递胰岛素抵抗信号，促进2型糖尿病（T2DM）及其并发症（如糖尿病肾病、脂肪肝）；又可通过脂肪源性干细胞（ADSCs）来源的sEVs（富含miR-486等）改善胰岛素敏感性并促进组织修复。文章重点解析了sEVs通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、核因子κB（NF-κB）等通路调控器官间通讯的机制，为代谢疾病治疗提供了新靶点。

　　

引言

糖尿病（DM）是一种慢性代谢性疾病，其特征为脂肪组织和骨骼肌中葡萄糖储存与利用障碍。2型糖尿病（T2DM）在肥胖个体中尤为常见，超重会引发炎症和胰岛素抵抗等健康并发症，最终导致T2DM的发生。脂肪组织、骨骼肌和内分泌胰腺之间的相互作用被认为是体重超标相关葡萄糖代谢紊乱的基础。细胞外囊泡（EVs）在介导细胞间通讯中发挥作用，可能参与肥胖个体T2DM及相关并发症的发病机制。源自脂肪组织的外泌体/小细胞外囊泡（sEVs）主要通过影响胰岛素抵抗，参与代谢综合征的进展或管理。

细胞外囊泡

细胞外囊泡是由各种细胞分泌到细胞外环境中的脂质双层囊泡。它们曾被认为是细胞碎片，现在则被认为是细胞间通讯的重要参与者。根据MISEV2023指南，基于生物发生的术语如“外泌体”（源自多泡体）和“ectosome”（源自细胞表面膜出芽）的使用需谨慎。国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议使用通用术语“EV”及其操作性子类。另一种广泛使用的分类方法是基于大小，例如sEVs（一般<200 nm）和lEVs（一般>200 nm）。尽管sEV和外泌体并非同义词，但在许多科学研究中这两个术语常互换使用。鉴于当前EV表征方法的局限性以及缺乏特定的生物发生标志物，本综述使用通用术语“小细胞外囊泡（sEVs）”来涵盖这些异质性群体。

小细胞外囊泡的生物发生

在外泌体生物发生的研究中，两种主要途径已被确认：内体分选复合物（ESCRT）依赖途径和ESCRT非依赖途径。外泌体生物发生始于内吞作用，形成早期内体，进而发育成多泡体（MVBs），通过向内出芽产生腔内囊泡（ILVs）。当MVBs与质膜融合时，ILVs作为外泌体被释放到细胞外。或者，MVBs可能与溶酶体或自噬体融合，导致内容物降解。

通过小细胞外囊泡进行细胞间通讯

有效的细胞间对话对于多细胞生物体的功能至关重要。在真核生物中，这种通讯由细胞外分子介导，包括激素、细胞因子、神经递质、微小RNA（miRNA）和生长因子。小细胞外囊泡/外泌体是细胞间通讯的一种值得注意的形式，它们具有杯状形态，直径在40到200纳米之间。这些囊泡具有脂质双层膜，分子组成包括蛋白质、核酸（DNA、RNA、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA））和脂质。脂肪组织来源的sEVs在维持细胞稳态和促进器官间通讯方面发挥着核心作用。

肥胖、脂肪来源的小细胞外囊泡的病理和治疗意义

如前所述，源自脂肪组织的EVs在生理和病理条件下发挥作用。在生理条件下，EVs调节骨骼肌、脂肪组织和肝脏的能量储存和消耗。然而，在病理条件下，它们可能促进癌症、内分泌紊乱、肥胖和T2DM的发生。在肥胖个体中，脂肪细胞经历细胞应激和肥大性扩张，伴随sEVs组成的改变。功能失调的脂肪细胞表现出不规则的sEVs分泌，这可能促进慢性合并症及相关并发症的发展。

另一方面，sEVs由于其能够选择性递送分子到靶组织而具有显著的治疗潜力。例如，在小鼠模型中，源自ADSCs的sEVs在摄取后促进巨噬细胞从促炎（M1）向抗炎（M2）表型极化。sEVs工程的最新进展探索了将其作为治疗性货物（包括miRNA模拟物、小干扰RNA（siRNA）和抗炎化合物）的载体，以减轻胰岛素抵抗。

脂肪组织来源的小细胞外囊泡与胰岛素抵抗和糖尿病相关并发症进展或改善相关的分子机制

脂肪来源的小细胞外囊泡/外泌体对胰岛素抵抗和糖尿病相关并发症进展的影响

本节重点介绍脂肪来源的sEVs/外泌体对胰岛素抵抗和糖尿病相关并发症进展的机制见解。例如，Dang等人报道，来自瘦素缺陷突变（ob/ob）小鼠和高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的脂肪细胞来源的外泌体，通过降低alpha小鼠肝12细胞中的AKT磷酸化水平和葡萄糖摄取来降低胰岛素敏感性。这些外泌体中miR-141-3p浓度较低，从而上调了10号染色体上的磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）的表达，对肝细胞中的PI3K/AKT信号通路产生负面影响。此外，来自肥大3T3-L1脂肪细胞的外泌体源性miR-802-5p通过降低大鼠伴侣蛋白热休克蛋白60（HSP60）的表达来损害心脏胰岛素敏感性。

脂肪组织来源的miRNA可通过多种机制导致胰岛素抵抗，包括降低胰岛素受体底物1（IRS-1）的表达水平。Li等人发现，来自性腺白色 adipose tissue（gWAT）的血清外泌体miR-222通过靶向肝脏和骨骼肌中的IRS1，加剧了HFD诱导的肥胖小鼠的胰岛素抵抗。还有报道称，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是脂肪细胞来源的外泌体miR-27a的靶点，其通过降低骨骼肌中IRS-1和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的表达来促进胰岛素抵抗。

脂肪细胞外囊泡（AdEVs）的脂质组在脂质介质介导的信号通路中起着重要作用，并对EV膜的形成和稳定性有重要功能。肥胖诱导了独特的AdEV脂质指纹，这些指纹可作为肥胖相关代谢功能障碍的介质。例如，Kumar等人指出，从肥胖的HFD喂养小鼠或T2DM患者粪便中分离的外泌体，其脂质组成发生改变，其中磷脂酰胆碱（PC）取代磷脂酰乙醇胺（PE）成为主要膜脂。这些外泌体被肝细胞摄取后，外泌体PC与芳烃受体结合并激活之，从而抑制胰岛素信号基因（如IRS-2、PI3K和Akt）的表达，导致胰岛素抵抗。

除了肝细胞、脂肪细胞和肌细胞等胰岛素抵抗细胞外，大脑现在被认为是胰岛素敏感器官，在全身能量稳态和葡萄糖代谢中起关键作用。脂肪组织来源的EVs及其货物介导了脂肪组织与大脑之间的器官间通讯。Wang等人证明，来自HFD喂养小鼠的AdEV携带的miR-9-3p抑制了脑源性神经营养因子的表达，并导致显著的突触损伤。Gao等人报告，肥胖小鼠脂肪细胞分泌的EVs富含长链非编码RNA MALAT1，可转移到 hypothalamic 厌食性 pro-opiomelanocortin（POMC）神经元中，通过竞争性内源RNA机制与miR-181b和miR-144相互作用，激活 mechanistic target of rapamycin（mTOR）信号通路，从而抑制POMC神经元活性，导致能量摄入和体重增加。

脂肪组织来源的小细胞外囊泡对炎症诱导的胰岛素抵抗的影响

研究表明，与肥胖相关的胰岛素抵抗是由脂肪组织炎症引起的。脂肪细胞和胰岛素敏感组织之间的相互作用参与了肥胖诱导的胰岛素抵抗的发病机制。Pan等人证实，附睾白色脂肪组织（eWAT）释放含有miR-34a的外泌体，巨噬细胞吸收这些外泌体后，由于Krüppel样因子4（Klf4）水平降低，导致巨噬细胞极化从M2向M1转变。这引发了促炎细胞因子的产生，促进组织纤维化，并降低脂联素水平，导致葡萄糖不耐受和全身性胰岛素抵抗。Deng等人发现，ob/ob小鼠的脂肪组织分泌的EVs通过Toll样受体4（TLR4）和TIR域包含适配器蛋白诱导干扰素β（TRIF）途径激活巨噬细胞。Song等人发现，胰岛素抵抗脂肪细胞来源的外泌体（IRADEs）中的Sonic Hedgehog（Shh）通过Ptch/PI3K信号调节M1极化。用IRADE处理的巨噬细胞通过降低激素敏感性脂肪酶（HSL）和IRS-1的表达使脂肪组织对胰岛素不敏感。Tang等人（2023年）指出，来自内脏脂肪细胞的外泌体源性miR-27b-3p通过激活核因子κB（NF-κB）通路和下调PPARα影响血管内皮细胞，促进内皮炎症和动脉粥样硬化形成。

Lago-Baameiro等人分析了肥胖中脂肪组织与肝脏通过EV（肥胖体）的相互作用。由发炎脂肪组织释放的sEVs在与巨噬细胞相互作用时能诱导促炎细胞因子的产生。与肝细胞相互作用时，这些囊泡会损害胰岛素敏感性（表现为Akt和S6磷酸化减少），改变脂质和葡萄糖代谢。此外，由脂肪变性肝细胞分泌的EVs（脂肪体）在健康肝细胞中诱导胰岛素抵抗并改变脂质和葡萄糖代谢。

脂肪组织巨噬细胞来源的小细胞外囊泡/外泌体对炎症和胰岛素抵抗的影响

脂肪组织巨噬细胞（ATMs）在调节全身和局部胰岛素敏感性中发挥作用。Ying等人报告，来自肥胖小鼠的ATMs来源的外泌体在给予瘦小鼠后会导致胰岛素抵抗。然而，用来自瘦小鼠的ATMs外泌体治疗肥胖小鼠可改善葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，而不影响体重。他们指出，ATM来源的外泌体miR-155可能靶向PPARγ，导致肥胖小鼠中GLUT4的下调。Liu等人指出，肥胖小鼠中高表达的ATM来源的外泌体miR-29a可传递给脂肪细胞、肝细胞和肌细胞，促进胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受。其他实验结果发现，来自瘦小鼠的外泌体上调miR-222-3p并下调Bim表达，从而在体外使巨噬细胞从促炎表型向抗炎表型再极化。Tian等人还发现，暴露于高葡萄糖水平的内脏脂肪组织（VAT）的巨噬细胞来源的外泌体中miR-210高水平表达。当与3T3-L1脂肪细胞共培养时，这些外泌体损害葡萄糖摄取并抑制线粒体呼吸链复合物I的NDUFA4（NADH脱氢酶泛醌1α亚复合体4）亚基。

来自肥胖个体/动物模型的循环小细胞外囊泡/外泌体对胰岛素抵抗相关并发症的影响

一项人体研究的数据表明，肥胖女性的循环外泌体可破坏胰岛素信号通路。来自肥胖女性的血浆外泌体显著降低了HepG2细胞中糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）和糖原的磷酸化水平。他们还发现肝细胞内甘油三酯含量升高和成纤维细胞生长因子21（FGF21）释放减少。研究表明，肥胖改变了小鼠血浆外泌体的miRNA谱，特别是导致miR-122、miR-192、miR-27a-3p和miR-27b-3p的上调。当给予瘦小鼠时，来自肥胖小鼠的外泌体靶向PPARγ，诱导肝脂肪变性和eWAT炎症，并导致血脂异常、胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。Wang等人研究报告，肥胖小鼠血清外泌体中mmu-miR-674-5p的显著差异表达表明其可能参与胰岛素抵抗的调节，并与PI3K-AKT信号通路有强烈关联。Hubal等人报告，胃绕道手术改变了循环脂肪细胞来源的微小RNA，其中29个关键微小RNA与改善的胰岛素敏感性以及胰岛素受体信号和WNT/β-连环蛋白通路等相关。

AdEVs含有高度表达的脂肪细胞蛋白，如脂肪酸结合蛋白4（FABP4）或perilipin-1。功能分类显示，肥胖中VAT来源的囊泡富含参与脂肪组织炎症和胰岛素抵抗的蛋白质，如TGFBI、CAVN1、CD14、mimecan、血小板反应蛋白-1、FABP4和AHNAK。Camino等人的研究表明，mimecan和TGFBI被确定为肥胖合并症的生物标志物。与健康瘦对照组相比，mimecan在肥胖患者（尤其是VAT来源的囊泡）和有T2DM病史的肥胖患者的AdEVs中上调。此外，与非糖尿病患者相比，在有T2DM病史的肥胖个体中观察到循环TGFBI阳性EVs显著增加。Saraswathi等人检查了正常个体以及肥胖和胰岛素抵抗个体血清外泌体的蛋白质组学谱。在肥胖胰岛素抵抗个体中，上调的蛋白质包括胰岛素信号标志物如VPS13C、TBC1D32和TTR，以及B细胞激活标志物如IGLV4-69、IGKV1D-13和IGHV4-28。相反，胰岛素增敏蛋白包括脂联素（ADIPOQ）、ficolin-3（FCN3）和锌α2-糖蛋白（AZGP1）显著下调。

最近的研究表明，来自胰岛素抵抗脂肪细胞的外泌体含有与胰岛素抵抗和T2DM密切相关的蛋白质，如calreticulin、S100A6、mimecan、PARK7/DJ-1、PPIB和tenascin。Eguchi等人报告，在饮食诱导的肥胖小鼠和患有代谢综合征的肥胖人类中，循环AdEVs中的perilipin A水平显著增加。

从脂肪源性干细胞分离的小细胞外囊泡/外泌体对改善胰岛素抵抗及其相关并发症的影响

本节重点介绍ADSC来源的sEVs/外泌体对改善胰岛素抵抗及其相关并发症的机制见解和治疗潜力。Jin等人发现，ADSC来源的外泌体通过降低糖尿病小鼠的足细胞凋亡、血清肌酐、蛋白尿和血尿素氮，减轻了1型糖尿病（T1D）相关的肾脏并发症。机制上，来自ADSC的外泌体增强了miR-486表达，并抑制了Smad1/mTOR信号通路，进而减轻了小鼠足细胞克隆-5细胞中的足细胞损伤和促进自噬。另一项研究发现，源自ADSCs的miRNA-215-5p通过抑制锌指E盒结合同源框2（ZEB2）的表达来减少足细胞的上皮-间质转化。Wang等人（2021年）发现，与常氧ADSCs外泌体相比，缺氧ADSCs外泌体中215个miRNA增加，369个miRNA减少。他们发现三个miRNA（miR-21-3p、miR-31-5p和miR-126-5p）的上调和两个miRNA（miR-146-a和miR-99b）的下调可以调节免疫反应、成纤维细胞增殖、成熟和迁移。实际上，在BALB/c裸鼠中，通过激活PI3K/AKT信号通路，糖尿病伤口和炎症得到改善。Shi等人揭示，当通过ADSC来源的外泌体递送时，mmu_circ_0000250在体内增强了糖尿病伤口愈合中的血管生成，并通过激活自噬减少细胞凋亡。进一步证实，mmu_circ_0000250通过上调去乙酰化酶1（SIRT1）和吸收miR-128-3p，增强了ADSC来源的外泌体在糖尿病伤口愈合中的治疗潜力。

Liang等人（2022年）指出了来自ADSC外泌体的mmu_circ_0001052的新机制。他们发现，mmu_circ_0001052通过miR-106a-5p、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和成纤维细胞生长因子4（FGF4）通路，抑制了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的凋亡，并增加了糖尿病足溃疡（DFU）糖尿病小鼠的血管生成。也有报道称，缺氧ADSC来源的外泌体中Circ-Snhg11的过表达通过海绵吸附miR-144-3p促进M2巨噬细胞极化和上调缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达，从而抑制高糖诱导的内皮细胞损伤并加速糖尿病小鼠的伤口愈合。Yin等人（2023年）的研究表明，含有circRps5的ADSC-外泌体促进了M2极化。circRps5的过表达增加了胶原合成，促进了伤口愈合，并减轻了炎症反应。关于AdEVs和外泌体应用于糖尿病相关伤口愈合的证据水平基于临床前但充满希望的结果。Zhao等人的一项研究中，ADSC来源的外泌体将活性STAT3转移到巨噬细胞中，从而激活精氨酸酶-1。因此，用ADSC来源的外泌体治疗肥胖小鼠改善了代谢稳态，包括胰岛素敏感性增加27.8%，肥胖减轻，葡萄糖耐量改善。这些外泌体诱导了M2巨噬细胞极化，减少了炎症，并促进了饮食诱导肥胖小鼠WAT的棕色化。

机制研究证明了动脉粥样硬化与脂肪组织来源的外泌体之间存在联系。据报道，来自SIRT1过表达ADSCs的外泌体增加了急性心肌梗死患者内皮祖细胞（EPCs）中C-X-C基序趋化因子12（CXCL12）和核因子E2相关因子2（Nrf2）的表达。这两个因子促进了EPCs的迁移和管形成，注射来自SIRT1过表达ADSCs的外泌体促进了心肌功能恢复，减少了梗死面积，减轻了梗死后左心室重构，诱导了新血管生成，并减少了心肌炎症。

此外，研究还证明了从脂肪来源的MSCs分离的外泌体在糖尿病视网膜病变中具有抗凋亡、抗炎、抗氧化和调节血管生成的作用，以及在非酒精性脂肪性肝炎中显著改善脂质代谢和炎症的作用。Kim B等人发现，MSC来源的外泌体通过AMPK-SIRT1-PGC-1α通路激活FGF21-脂联素轴，从而减轻饮食诱导的肥胖小鼠的肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗。

脂肪来源的小细胞外囊泡/外泌体对改善胰岛素抵抗及其相关并发症的影响

Hartwig等人进行的WAT分泌组的蛋白质组学分析确定了817种外脂肪因子（由外泌体运输的蛋白质）。作者将SERPINF1、COL5A3、COL1A1、C3、RBP4、GPD1和TUBA1C与内分泌紊乱、代谢疾病和T2DM联系起来。在各种脂肪因子中，脂联素的寡聚形式主要位于sAdEVs的外表面。这些sAdEVs作为脂联素的稳定载体，与脂联素受体结合，在体外显示出胰岛素增敏作用。当将这些从瘦脂肪组织获得的富含脂联素的sAdEVs注射到喂食HFD的小鼠体内时，它们可以预防肝脏和脂肪组织中的肥胖、胰岛素抵抗和炎症。此外，已知脂联素通过与T-钙粘蛋白结合来调节外泌体的生物发生和分泌。

除了脂联素，另一个值得注意的EV内容是核磷蛋白3（NPM3），它与各种代谢过程有关。在HFD诱导的肥胖小鼠中检查了NPM3在sEVs-BAT功能中的作用。给小鼠静脉注射sEVs-BAT或NPM3敲低的sEVs-BAT（sEVs-BAT-siNPM3）。施用sEVs-BAT减轻了HFD诱导的体重增加，减少了腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和附睾白色脂肪组织（eWAT）质量，缓解了脂肪细胞肥大，改善了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，降低了空腹血糖水平，并降低了脂肪组织中促炎基因（如IL-1β和IL-6）的表达。当BAT-sEVs中的NPM3被敲低时，这些效应被消除。先前的研究报告称，NPM家族与各种内分泌和代谢紊乱有关，包括有氧糖酵解受损、胰岛素受体表达改变、肥胖和衰老。然而，NPM3的生物学功能，特别是在调节脂肪组织稳态方面，在很大程度上仍未明确。此外，如Kulaj等人所示，来自饮食诱导肥胖小鼠的脂肪细胞来源的EVs携带胰岛素促分泌蛋白货物，增强了葡萄糖刺激的胰岛素分泌的第一阶段，这在瘦小鼠的EVs中未观察到。因此，脂肪组织中胰岛素抵抗的状态通过EVs传递给胰腺β细胞，以满足增加的胰岛素需求。因此，需要更多的研究来验证来自肥胖人类的脂肪细胞来源的EVs是否可以改善或损害胰岛素抵抗。

白色脂肪组织来源的小细胞外囊泡与棕色脂肪组织来源的小细胞外囊泡

WAT和BAT具有根本不同的代谢作用。BAT是一种产热脂肪，是对抗肥胖和代谢疾病的有力武器，在维持葡萄糖稳态、改善β细胞功能和减少胰岛素需求方面起着至关重要的作用。相反，肥胖中扩张的WAT作为能量储存库并分泌促炎信号。与这些作用一致，来自WAT与BAT的外泌体信号对胰岛素敏感性的影响显著不同。

在肥胖和T2DM中，WAT释放富含miRNA和细胞因子的sEVs，促进胰岛素抵抗。例如，性腺WAT外泌体miR-222在胰岛素抵抗的肥胖人类和HFD喂养的小鼠中显著上调。这些WAT来源的外泌体抑制肝脏和肌肉中的IRS1/AKT信号，从而损害胰岛素作用和葡萄糖耐量。类似地，来自肥胖WAT的外泌体激活炎症巨噬细胞（通过TLR4/RBP4途径）并升高肿瘤坏死因子α（TNF-α）/白细胞介素-6（IL-6）水平，进一步驱动全身性胰岛素抵抗。因此，WAT来源的sEVs通常携带“坏”信号，加剧代谢功能障碍和T2DM。

相比之下，来自健康、激活的BAT的sEVs/外泌体传递良好的代谢信号。在肥胖小鼠模型中，静脉注射BAT来源的外泌体减少了肥胖，降低了血糖，并改善了葡萄糖耐量。蛋白质组学和miRNA分析表明，BAT来源的外泌体富含线粒体蛋白和调节性miRNA。例如，BAT外泌体miR-99b靶向肝脏的FGF21基因以改善葡萄糖代谢，而miR-132-3p抑制脂肪生成因子SREBF1。这些效应共同增强了胰岛素敏感性。在人类中，直接研究有限，但已知BAT激活（例如通过寒冷）可以改善葡萄糖处置，这意味着BAT来源的外泌体因子可能介导了部分益处。

总的来说，目前的证据指向一个清晰的二分法：WAT来源的sEVs（尤其是来自肥胖或发炎脂肪的）携带促糖尿病货物，诱导胰岛素抵抗，而BAT来源的sEVs携带抗糖尿病货物，增强胰岛素敏感性。这种功能对比强调了脂肪组织相互作用中的一个重要机制轴。

小细胞外囊泡治疗中的转化挑战

SAdEVs在调节糖尿病和肥胖代谢方面显示出前景，但其临床转化受到多种实际障碍的阻碍。大规模生产是困难的；治疗剂量需要在良好生产规范（GMP）条件下扩增供体脂肪细胞，但通常产量非常低，且批次间一致性差。例如，Li等人指出，当前的细胞培养和纯化技术限制了外泌体标准化和大规模生产的实施，并强调迫切需要可扩展的制造工艺。实际上，即使是MSC来源的外泌体（包括来自脂肪MSCs的）生产力也很低，并且没有标准化的GMP方案。同样，分离和表征方法缺乏标准化：每个实验室使用不同的EV纯化技术（超速离心、过滤、沉淀等），产生具有不同纯度和含量的囊泡。国际细胞外囊泡学会已发布MISEV指南以统一表征标准（例如标志物组、纯度指标），但采用程度不均，许多研究报告的EV分析不完整。这种方法的变异性使得很难比较结果或确保脂肪来源的外泌体制剂包含预期的生物活性货物。

监管和安全问题增加了进一步的复杂性。监管机构将外泌体治疗剂分类为生物制品或细胞来源产品，需要严格的质量控制，但尚未有任何EV基药物获得批准。关键问题包括细胞来源的外泌体固有的异质性和未知的作用机制；即使是脂肪MSCs产生的囊泡，其组成也随培养条件而变化。临床前报告也强调了MSC-EVs的潜在危害。外泌体可能引发免疫反应或血栓形成，并可能携带不需要的货物（例如促凝血因子或病原体）。因此，申办者必须证明一致的颗粒特性、效力和安全性（例如缺乏致癌或炎症活性）才能临床使用，这一过程因复杂EV混合物的分析工具有限而变得复杂。

此外，外泌体的储存和稳定性也是限制因素。sEVs本质上是脆弱的。在液体中，它们会迅速降解或聚集，反复冻融循环会破坏膜完整性和货物。尽管存在冷冻保存或冻干方法，但没有共识的最佳实践，并且保质期数据稀少。因此