小胶质细胞NLRC5通过稳定ISG15破坏溶酶体功能加剧脑卒中后神经炎症的新机制

《Journal of Neuroinflammation》：Microglial NLRC5 drives lysosomal dysfunction to disrupt autophagic flux and promote post-stroke neuroinflammation

本研究针对缺血性脑卒中后小胶质细胞过度激活导致持续神经炎症的关键难题，揭示了NLRC5通过结合ISG15破坏自噬流、加剧溶酶体功能障碍的新通路。研究人员发现微胶质细胞特异性敲除Nlrc5可显著改善小鼠神经功能缺损并缩小梗死体积，证实NLRC5-ISG15轴是卒中免疫调控的潜在治疗靶点。

　　

当大脑的血管突然堵塞，缺血性脑卒中就发生了。这不仅是全球第二大死亡原因，更棘手的是，即便通过溶栓或取栓实现了血管再通，仍有约40%的患者因继发性神经损伤而预后不良。其中，大脑中的常驻免疫细胞——小胶质细胞——的过度激活和随之而来的持续神经炎症，被认为是导致二次损伤的“罪魁祸首”。正常情况下，小胶质细胞像大脑的“巡逻兵”，维持着脑内的免疫平衡。然而，缺血发生后几分钟内，它们就会被迅速激活，释放大量肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子，直接攻击神经元，加重脑损伤。因此，如何调控小胶质细胞的炎症反应，已成为卒中治疗研究的热点。

自噬是细胞内部一个重要的“清道夫”系统，它能将受损的蛋白质或细胞器包裹形成自噬体，再与溶酶体融合并将其降解，从而维持细胞稳态。在卒中研究中，自噬对小胶质细胞炎症的调节作用却充满争议：有的研究发现抑制自噬能减轻炎症，有的则显示促进自噬反而有保护作用。问题的关键可能在于“自噬流”是否畅通——即自噬体能否顺利与溶酶体融合并完成降解。如果溶酶体功能受损，自噬体就会大量堆积，导致自噬流“堵塞”，这种状态不仅无法发挥保护作用，反而会助长炎症信号。因此，阐明小胶质细胞中调控溶酶体功能的关键分子，对于理解卒中后神经炎症至关重要。

NOD样受体家族CARD结构域包含蛋白5（NLRC5）是NOD样受体（NLR）家族中的重要成员，在多种免疫和炎症性疾病中扮演着复杂角色，但其在缺血性脑卒中中的作用却完全未知。发表在《Journal of Neuroinflammation》上的这项研究，首次系统揭示了NLRC5通过干扰溶酶体功能破坏小胶质细胞自噬流，从而加剧卒中后神经炎症的全新机制。

为了回答上述科学问题，研究人员运用了多种关键技术方法。他们构建了微胶质细胞特异性Nlrc5条件性敲除（mCKO）小鼠，并利用小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型模拟临床缺血性脑卒中。研究结合了激光散斑对比成像（LSCI）监测脑血流、行为学测试评估神经功能、TTC染色测定梗死体积、TUNEL染色检测神经元凋亡。在细胞水平，采用原代小胶质细胞培养和氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，通过蛋白质组学分析、免疫共沉淀（Co-IP）、邻近连接实验（PLA）等技术探索分子机制，并利用mRFP-GFP-LC3腺病毒报告系统动态监测自噬流，通过LysoSensor/LysoTracker染色评估溶酶体酸化和功能。此外，研究还分析了卒中患者死后脑组织样本以验证临床相关性。

NLRC5在脑缺血后半暗带小胶质细胞中显著上调

研究人员首先发现在tMCAO小鼠模型的缺血半暗带，NLRC5的蛋白和mRNA水平在卒中后1至7天均显著升高。通过免疫荧光染色进一步定位，发现NLRC5主要表达于半暗带区域的Iba1⁺小胶质细胞，而与神经元（NeuN⁺）和星形胶质细胞（GFAP⁺）共定位较少。在卒中患者死后脑组织的半暗带区域，也观察到小胶质细胞中NLRC5表达升高的趋势。这些结果表明NLRC5在卒中急性期被特异性激活于小胶质细胞。

微胶质细胞特异性敲除Nlrc5减轻缺血性脑损伤

为了明确NLRC5的功能，研究者构建了Tmem119-CreERT2; Nlrc5^fl/fl（mCKO）小鼠。在tMCAO手术后，与对照（Nlrc5^fl/fl）小鼠相比，mCKO小鼠的生存率显著提高，神经功能缺损评分（mNSS）降低，转棒实验潜伏期延长，抓力增强，脚误测试错误率下降。TTC染色显示mCKO小鼠的脑梗死体积显著减小，TUNEL/NeuN双标染色则发现其半暗带神经元凋亡明显减少。这些结果证实了特异性敲除小胶质细胞中的Nlrc5能有效减轻缺血性脑损伤。

敲除微胶质细胞Nlrc5抑制卒中后神经炎症和微胶质细胞活化

通过流式细胞术分选卒中后缺血半球的小胶质细胞进行PCR阵列分析，发现mCKO小鼠小胶质细胞中多个促炎基因（如Il1b, Cxcr1）表达下调。RT-qPCR和ELISA验证了半暗带组织中Il6、Il1b、Nos2、Tnf等促炎因子mRNA和蛋白水平在mCKO小鼠中显著降低。形态学分析显示，mCKO小鼠半暗带小胶质细胞的Iba1平均荧光强度（MFI）更低，且其细胞突起更长、分支更多、形态更接近静息状态，表明Nlrc5缺失抑制了小胶质细胞的炎症反应和形态学上的过度活化。

NLRC5加剧炎症反应并促进微胶质细胞介导的神经元死亡

体外实验表明，LPS刺激或OGD/R处理均能显著上调原代小胶质细胞中NLRC5的表达。从Nlrc5全身敲除（Nlrc5 KO）小鼠分离的原代小胶质细胞，在受到OGD/R、LPS、神经元碎片或神经元上清等多种刺激时，其促炎因子（Il6, Il1b, Nos2, Tnf）的表达和释放（TNF-α, IL-6）均低于野生型（WT）细胞。将不同处理组小胶质细胞的条件培养基作用于经历OGD/R的原代神经元后，发现Nlrc5 KO小胶质细胞条件培养基组的神经元凋亡率显著低于WT组，证明NLRC5通过增强小胶质细胞的炎症反应加剧了神经元损伤。

NLRC5介导的微胶质细胞炎症与溶酶体和自噬功能障碍相关

对OGD/R处理后的WT和Nlrc5 KO原代小胶质细胞进行蛋白质组学分析发现，差异表达蛋白（DEPs）显著富集于溶酶体功能、自噬、TNF信号通路等。KEGG和GO分析提示NLRC5可能负向调控溶酶体功能。RT-qPCR验证了Nlrc5敲除后多个溶酶体水解酶（如Ctsb, Ctsd）的mRNA表达上调。使用溶酶体抑制剂Bafilomycin A1（BAF）抑制溶酶体功能后，小胶质细胞在OGD/R后的炎症反应进一步加剧，说明溶酶体功能受损会放大炎症，而NLRC5的促炎作用可能与此相关。

Nlrc5敲除恢复OGD/R损伤的溶酶体功能并促进自噬流

Western blot结果显示，OGD/R引起原代小胶质细胞中自噬体标记LC3-II和自噬底物SQSTM1/p62同时积累，提示自噬流受阻。Nlrc5敲除显著降低了LC3-II和p62的积累。加入BAF后，WT和Nlrc5 KO组间的LC3-II积累无差异，且自噬起始相关蛋白ATG3和ATG7的表达不受影响，说明Nlrc5敲除不影响自噬体形成，而是促进其降解。透射电镜（TEM）直接观察到Nlrc5 KO细胞中OGD/R诱导的自噬体积累减少。mRFP-GFP-LC3双荧光报告系统显示，Nlrc5敲除提高了自噬流速率（RFP:GFP比值）。功能上，Nlrc5敲除恢复了OGD/R损伤的溶酶体酸化和成熟形式的水解酶CTSB、CTSD的表达，表明其通过修复溶酶体功能促进了自噬流的畅通。

NLRC5与微胶质细胞中的ISG15结合并上调其蛋白水平

通过Co-IP联合质谱分析，研究者发现干扰素刺激基因15（ISG15）是NLRC5的潜在结合蛋白。在体实验证实，mCKO小鼠卒中后半暗带ISG15蛋白水平显著降低，且ISG15主要与Iba1⁺小胶质细胞共定位。Co-IP和邻近连接实验（PLA）均在原代小胶质细胞中验证了NLRC5与ISG15的直接相互作用。体外实验中，OGD/R诱导的ISG15上调在Nlrc5 KO细胞中被显著抑制。

NLRC5以ISG15依赖的方式加剧溶酶体功能障碍和微胶质细胞炎症

为了确认ISG15的下游作用，研究者构建了微胶质细胞特异性Isg15条件性敲除（Isg15 CKO）小鼠。在Isg15敲除的原代小胶质细胞中，过表达NLRC5不再能引起OGD/R后成熟CTSD、CTSB表达的下降，即ISG15的缺失逆转了NLRC5对溶酶体功能的破坏。同样，NLRC5过表达在OGD/R后对促炎因子（Il6, Il1b等）mRNA和蛋白（IL-6, TNF-α）水平的提升作用，在Isg15敲除细胞中也完全被消除。这些结果证明NLRC5依赖ISG15来发挥其促溶酶体功能障碍和促炎作用。

NLRC5通过其CARD结构域结合ISG15并特异性抑制其经自噬-溶酶体途径的降解

环己酰亚胺（CHX）追踪实验显示，在Nlrc5 KO小胶质细胞中，ISG15的降解速度显著快于WT细胞。抑制剂实验发现，自噬-溶酶体途径抑制剂氯喹（CQ）和BAF能逆转Nlrc5敲除导致的ISG15减少，而蛋白酶体抑制剂MG132则无此效果，表明ISG15主要通过自噬-溶酶体途径降解，NLRC5抑制了这一过程。结构域映射实验和分子对接模拟预测表明，NLRC5通过其N端的CARD结构域与ISG15结合，其中Ser-125、Ser-129和Arg-132等残基可能参与形成氢键。

本研究结论清晰地指出，在缺血性脑卒中后，小胶质细胞中的NLRC5表达上调，通过其CARD结构域直接结合ISG15，并像“盾牌”一样保护ISG15免受自噬-溶酶体系统的降解，导致ISG15蛋白稳定性增加。累积的ISG15进而引起溶酶体功能紊乱（酸化和关键水解酶活性受损），破坏自噬流，最终导致小胶质细胞持续释放促炎因子，加剧神经炎症和脑损伤。反之，特异性敲除小胶质细胞中的Nlrc5则能通过恢复溶酶体功能和自噬流，有效抑制炎症，发挥神经保护作用。

这项研究的重大意义在于，它首次揭示了NLRC5-ISG15轴是调控小胶质细胞自噬-溶酶体功能及其炎症状态的关键开关，为理解卒中后神经炎症的持续存在提供了全新的分子视角。所发现的NLRC5-ISG15相互作用界面，为开发能够特异性阻断该相互作用、从而精准调控小胶质细胞炎症反应的靶向药物提供了理论依据和潜在的干预新策略，对于改善缺血性脑卒中患者的预后具有重要的转化价值。